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I C S 1 1.2 2 0s 4 1中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准N Y/T 5 7 3一2 0 0 2弓 形虫 病诊断 技术D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r t o x o p l a s mo s i s2 0 0 2 一 0 8 一 2 7发布加0 2 门2 一 0 1实施中 华 人 民 共 和 国 农 业 部发 布N Y/r 5 7 3-2 0 0 2前A 弓形虫病是由刚第弓形虫(r o x o p l a s m a g o n d i i)引起的一种人畜共患寄生虫病 该病呈世界性分布，各种家畜，包括猪、牛1 羊、犬、猫和实验动物，包括小白鼠、天竺鼠、家兔等，以及人类，都能感染弓形虫弓形虫病可使孕畜流产死胎，急性弓形虫病可造成家畜的死亡。弓形虫感染孕妇后可引起流产，胎儿畸形或产出弱智儿。弓形虫感染成人后，可侵害神经系统、呼吸系统、心脏、淋巴内皮系统等多种器官或系统，并造成损伤，严重时会造成死亡。因此。弓形虫病具有重要的公共卫生意义 本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归门。本标准起草单位:中国农业大学、中国农业科学院兰州兽医研究所 本标准主要起草人:汪明、杜重波、潘保良、刘群N Y/r 5 7 3-2 0 0 2弓形虫病诊断技术范 围本标准规定 f弓形虫病的诊断技术要求。本标准所规定弓形虫的分离鉴定适用于本病的确诊;间接血凝试验适用于大批量样品的普查。弓形虫的分离鉴定2 门材料准备2 门门器材:玻璃组织研钵，无菌砂子，5 ml注射器及f头2.1.2 0.8/生理盐水:加人青霉素和链霉素，使其终浓度分别为1 0 0 I t !m 工和1 0 p g/m l.o2 门 3 蛋自酶2.1.4 健康实验小白鼠2 7只。2.2 待检样品的采集及处理 无菌采取病畜的脑组织、心、肝、肺、肾、骨骼肌各2 g，以及3 m l腹腔液，所取组织或器官材料分别放人玻璃组织研钵中。加人无菌砂子和。.8%的无菌盐水进行研磨，研磨成组织糜。研磨好的组织(器官)，用 0.8%的盐水配制成 1 0%2 0%的组织悬浮液。肺组织和肌肉组织悬浮液加人蛋白酶消化。消化后的组织悬浮液用于接种，腹腔液不用处理可直接接种。2.3 操作方法 接种:选取 2 7只健康试验用小白鼠，分为9 组，每组 3只。作如下处理:空白对照组(1 组):不作任何处理;生理盐水接种组(1 组):每只小鼠腹腔接种生理盐水 1 m工;病料接种组(共7 组):每只小鼠分别腹腔接种 2.2 所制备的待检样品 I ml。2.4 检查与判定 小鼠接种待检样品后，如在 2 d-1 4 d内发生死亡，则应抽取腹腔渗出液涂片镜检。同时另采集脑、肝、肺、脾涂片，涂片进行姬姆萨染色后用显微镜镜检。若小鼠未发生死亡 则应在接种后的6-8 周对小鼠进行捕杀，并按 卜 述方法取样镜检。若在小鼠腹腔液中查出速殖子”或所取的组织样品中查出包囊“，或缓殖子弓 ，则可将待检样品判为阳性。没有查出则判为阴性 S 空自对照组和生理盐水接种组没有查出弓形虫时，可进行结果判定.否则应重检 当所检样品中，有一个为阳性，即说明被检动物已被弓形虫感染，将其判为阳性;当所检样品全部为阴性时，将被检动物判为阴性)速殖r 呈月芽形，长为 1,.,-8 p n，宽为2 1。t V m2)包囊内什衬充满圆形或月芽状的缓殖子.缓殖子长为 33)缓fi t f 对姬姆萨染液高度敏感，呈嗜碱性包囊呈球形 囊壁薄.汽径为2 s 1-1 0 0 u,nt,n.宽为 2 脚 1 1 一幻川NY/r 5 7 3 2 0 0 23 间接血凝试验OH A试验)11 材料准备3.1.1 9 6(1 2 x8)孔 I I 0 0 V形有机玻璃反应板，1 0 0 p L微量加样器，振荡器 K用离心机，移液管等。31.2 弓形虫诊断制剂(I I I 八抗原)，稀释液，阳性、阴性 血清3.2 操作方法3.2-1 弓形虫诊断制h 9 按瓶上标示毫升数加人灭菌蒸馏水稀释摇匀，5 0 0 r:m i n -2 0 0 0 r/m i n 离心5 mi n 一1 0 m i n，弃上清液、加等量稀释液摇匀，置 4 C 卜 静置 2 4 h后使川.12.2 采被检疫动物或 人的血液 2 ml,-2.5 n il，分离血清(应无血球)。3.2.3 川微W:加样器往9 6 孔有机玻璃反应板梅孔加7 5 I A.稀释液 每个样品加4 孔。每块板设阳性、阴性 III 9 4 对照对照均加 8 孔3.2.4 1 1 齐组第!孔加2 5 r d的被检血清，或阳性血清，或阴性血清12.5 用加样器对每组进行 1:4系列稀释，被检血清组稀释至第 3 孔。阳、阴性对照组稀释至第 7 孔。被检血清组第 4 孔。阳、阴性对照组第 8 孔为稀释液(见表 1)表 1 各组各孔的稀释度3.2.6 将准备好的诊断液摇匀。用移液管加 2 5 u I诊断液于每孔中加完后将反应板置微型振荡器上振荡 I m i n-2 mi n，直至诊断液中的血球分布均匀，从振荡器上取下反应板，用干净的玻璃板或纸板盖住反应板，以防灰尘落人，置2 2 C-3 7 C 静置 2 h-3h 后观察结果3.3 判定 在阳性对照血清滴度不低于1:1 0 2 4(第5 孔);阴性对照血清除第1 孔允许存在前滞现象(+)外，其余各孔均为(一);稀释液对照为(一)的前提下，对被检血清进行判定，否则应重做。间接血凝试验的判定标准如下:+十一4-,1 0 0%红细胞在孔壁下部呈均质的膜样凝集边缘整齐，致密因重力关系，膜样凝集的红细胞有时出现 卜 汾现象 +:7 5 环的红细胞在孔壁下部呈膜样凝集，不凝集的红细胞在孔底中央集中成很小的圆点。，十一 f-,5 0%的红细胞在孔壁更下部呈稀疏的凝集，不凝集的红细胞在孔底中央集中成较大的圆点。.+”:2 6%的红细胞在孔底凝集，其余不凝集的红细胞在孔底中央集中成大的圆点。一”:所有的红细胞均不凝集，并集中于孔底中央呈规则的最大的圆点 被检血清第 s 孔(I:6 4 稀释)达到“+”或以卜，将被检样品判为阳性。被检血清第 3 孔(I:6 4 稀释)为“+”或“一”，将被检样品判为阴性。