GBT 28081-2011 烟草环斑病毒检疫鉴定方法.pdf

I C S6 5 0 2 0 0 1B1 6囝圄中华人民共和国国家标准G B T2 8 0 8 1 2 0 1 1烟草环斑病毒检疫鉴定方法D e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no ft o b a c c or i n g s p o tv i r u s2 0 11-1 2-3 0 发布2 0 1 2-0 6-0 1 实施宰瞀鬻鬻瓣警糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会厘1 1 1刖罱G B T2 8 0 8 1-2 0”本标准按照G B T1 1 2 0 0 9 给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(S A C T C2 7 1)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈青、林石明、杨翠云、张毅、陈红运、廖富荣、郑云、李斌。1 范围烟草环斑病毒检疫鉴定方法G B T2 8 0 8 1 2 0 11本标准规定了烟草环斑病毒检疫鉴定的基本原则和方法。本标准适用于可能携带烟草环斑病毒的种子、苗木、鳞球茎、组培苗等繁殖材料及其产品的检疫鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文侔。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。S N T1 1 4 6 植物检疫烟草环斑病毒检疫鉴定方法。3 烟草环斑病毒基本信息中文名：烟草环斑病毒。学名：t o b a c c or i n g s p o tv i r u s。缩写：T R S V。属豇豆花叶病毒科C o m o v i r i d a e，线虫传多面体病毒属N e p o v i r u s 病毒。T R S V 的传播途径多样，可以通过种子、嫁接、机械接种和介体传播。烟草环斑病毒其他信息参见附录A。4 方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(D A S-E L I S A)、体外反转录和体外D N A 合成技术的反转录聚合酶链式反应(R T-P C R)进行检测鉴定。5 仪器设备、用具及试剂5 1 仪器设备洗板机、酶联检测仪、高速冷冻离心机、电子天平(感量0 0 0 1g)、超净工作台、旋涡混合仪、P C R仪、实时荧光P C R 仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、榨汁机、水浴锅。5 2 用具微量移液器(O 5p L，2p L，1 0p L，2 0p L，1 0 0p L，2 0 0 p L，10 0 0 弘L)、化学P C R 反应管和(或)9 6 孔光化学P C R 反应板、酶联板、研钵。5 3 试剂双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂(见B 1)。】G B T2 8 0 8 1 2 0 1 1反转录聚合酶链式反应(R T-P C R)检测试剂(见C 1)。实时荧光R T-P C R 检测试剂(见D 1)。I c _ R T-P C R 检测试剂(见E 1)。6 种苗的检测鉴定6 1 种子检测鉴定挑取5 0 0 粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中，待长出3 片4 片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组(1 0 株为1 组)并编号。采集的叶片分成两份，分别用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联铡定和分子生物学检测。6 2 苗木、组培苗检测鉴定有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同6 1。6 3 鳞球茎检测鉴定取鳞球茎的小芽或鳞片进行酶联测定和分子生物学检测。6 4 植物产品的检测鉴定植物产品有症状的部分单独检测。没有症状或无法的观察症状的植物产品，应按比例取样，检测方法为酶联测定和分子生物学检测。7 检测7 1双抗体夹心酶联免疫吸附测定把制备的样品上清液加入已包被T R S V 抗体的9 6 孔酶联板中，进行D A S-E L I S A 检测，每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染T R S V 的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料(如：种子或叶片)应尽量与检测样品相一致。具体操作见附录B。7 2R T-P C R 检测分别提取样品和对照的总R N A，反转录合成c D N A 后，进行P C R 扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染T R S V 的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录c。7 3 实时荧光P e R 检测分别提取样品和对照的总R N A，反转录合成c D N A 后，进行实时荧光P C R 检测。健康的植物组织作阴性对照，感染T R S V 的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录D。7 4I C-R T-P C R 检测把制备的样品上清液加入已包被T R S V 抗体的离心管中，然后进行I C-R T-P C R 扩增。健康的植2物组织作阴性对照，感染T R S V 的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录E。8 结果判定G B T2 8 0 8 1 2 0 1 17 1、7 2、7 3、7 4 中如果两种方法的检测结果为阳性，即可判断该批种苗携带烟草环斑病毒。一般是酶联测定为阳性后，分子生物学检测为阳性即可判断为携带有烟草环斑病毒。必要时可进行生物接种试验，具体操作按照S N T1 1 4 6 规定的方法执行。9 样品保存、结果记录与资料保存9 1 样品保存经检验确定携带烟草环斑病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4，病株在一2 0 或者-8 0 冰箱中保存，做好标记和登记工作。9 2 结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和检测人员的签字。酶联测定应有酶联板反应原始数据，R T-P C R 检测应有扩增结果图片，生物学接种应有症状照片。3G B T2 8 0 8 1 2 0 1 1A 1 寄主范围附录A(资料性附录)烟草环斑病毒简介T R S V 自然寄主范围非常广泛，可侵染5 4 科3 0 0 多种植物，主要的经济作物有：大豆(G l y c i n em a x)、马铃薯(S o l a n u mt u b e r o s u m)、甘薯(I p o m o e ab a t a t a s)、烟草(N i c o t i a n at a b a c u m)、西瓜(C i t r u l l u s l a n a t u s)、黄瓜(C u c u m i ss a t l r n 2 s)、甜瓜(c u c u m i sm e l o)、胡萝h(D a u c u sc a r o t a)、唐菖蒲(G l a d i o u sc u m m u n i s)、李属(P r u n u sL)、葡萄(V i t i sv i n i f e r a)等。A 2 病害症状因寄主不同可产生不同的症状，一般在生长季节初始，幼嫩植株上的症状较严重，而在生长季节后期不太明显。T R S V 造成叶片系统褪绿斑、坏死环斑，茎顶枯，根腐烂，危害严重时导致植株矮化，结果少和果实变小畸形。有的症状在后期可恢复，表现为无症带毒。大豆：顶芽卷曲(芽枯萎)，其他芽逐渐变褐色且易碎。在茎干和多数叶片的叶柄上产生褐色条纹，豆荚不发达且结实。在结荚后感染则可能产生黑色污点。烟草：在叶片上产生环形及线状斑，植株矮化。葫芦：植株矮化、叶片斑驳、果实畸形。葡萄：新长出的枝条柔弱、稀疏，节间变短。叶小且扭曲植株矮小、产果少且变形。A 3 分布地区T R S V 在日本、韩国、印度、中国台湾地区、美国、土耳其、加拿大、墨西哥、阿根廷、巴西、澳大利亚、新西兰等5 0 多个国家和地区均有分布。A 4 传播途径T R S V 在大豆上的种传率有时可达到1 0 0。主要的传播介体为美洲剑线虫X i p h i n e m aa m e r i c n n“m。此外在实验室条件下确定能传播T R S V 的昆虫介体有许多，如烟蓟马T h r i p s t a b a c i 和烟草跳甲E p i t r i xh i r t i p e n n i s 等。A 5 血清学特性T R S V 免疫原性强。A 6 粒体形态病毒粒体为等轴二十面体球状颗粒，直径约2 8r i m。A。7 基因组G B T2 8 0 8 1 2 0 1 1病毒基因组含两条s s R N A。R N A 一1 长75 1 4n t，R N A 一2 长39 2 9n t，外壳蛋白基因15 4 8n t。5G B T2 8 0 8 1 2 0 1 1B 1 试剂附录B(规范性附录)双抗体夹心酶联免疫吸附测定B 1 1 包被抗体特异性的烟草环病毒抗体。B 1 2 酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的烟草环斑病毒抗体。B 1 3 底物对硝基苯磷酸二钠(p N P P)B 1 4 样品抽提缓冲液(p H 7 4)P B S T1LN a 2 S 0 31 3gP V P(M W 2 40 0 0 4 00 0 0)2 0gN a N 30 2g用N a O H 或H C l 调节p H 值到7 4。4 储存。B 1 5 包被缓冲液(p H 9 6)N a 2 C 0 31 5 9gN a H C 0。2 9 3gN a N 30 2g加入9 0 0 m L 蒸馏水溶解，用H C I 调节p H 值到9 6，蒸馏定容至1 L。4 储存。B 1 6P B S T 缓冲液(洗涤缓冲液p H 7 4)N a C l8 0gN a 2 H P 0 41 1 5gK H 2 P 0 40 2gK C l0 2gT w e e n-2 00 5 m L加入9 0 0 m L 蒸馏水溶解，用N a O H 或H C I 调节p H 值到7 4，蒸馏水定容至1 L。每升P B S 中加入0 5m L 的T w e e n-2 0。B 1 7 酶标抗体稀释缓冲液(p H 7 4)P B S T1LB s A(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉2 0g6P V P(M W 2 40 0 0 4 00 0 0)2 0 ogN a N 30 2g用N a O H 或H C l 调节p H 值到7 4，4 储存。B 1 8 底物(p N P P)缓冲液(p H 9 8)M g C l 20 1gN a N 30 2g二乙醇胺9 7 m L溶于8 0 0 m L 蒸馏水中，用H C l 调p H 值至9 8，蒸馏水定容至1L。4 储存。B 2 程序G B T2 8 0 8 1-2 0 1 1B 2 1 包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，1 0 0 p L 孔，加盖，室温避光孵育4 h 或4 冰箱孵育过夜，清空酶联板孔中溶液，P B S T 洗涤4 次6 次。B 2 2 样品制备待测样品按1：1 0(重量：体积)加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，20 0 0r m i n，离心1 0m i n，上清液即为制备好的检测样品。样品提取缓冲液作空白对照，阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。B 2 3 加样加入制备好的检测样品、空白对照、阴性对照、阳性对照，1 0 0 p L 孔，加盖，室温避光孵育2h 或4 冰箱孵育过夜，清空酶联板孔中溶液，P B S T 洗涤4 次6 次。B 2 4 加酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，1 0 0p L 孔，加盖，室温避光孵育2h，清空酶联板孔中溶液，P B S T 洗涤4 次6 次。B 2 5 加底物将底物p N P P 加入到底物缓冲液中使终浓度为1m g m L(现配现用)，按1 0 0p L 孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。B 2 6 读数用酶联检测仪在3 0 m i n、1h 和2h 于4 0 5n m 处读O D 值。B 3 结果判断B 3 1 对照孔的O D 4 s o 值(缓