GBT 28075-2011 萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型检疫鉴定方法.pdf

I C S6 5 0 2 0 0 1B1 6囝园中华人民共和国国家标准G B T2 8 0 7 5 2 01 1萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型检疫鉴定方法D e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fP s e u d o m o n a ss a v a s t a n o ip v p h n s e D f i c o Z 口(B u r k h o l d e r)G a r d a ne ta 1 2 0 11-1 2-3 0 发布2 0 1 2 0 6 0 1 实施宰瞀鹊紫瓣警糌瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会促1 9前言G B T2 8 0 7 5-2 0 1 1本标准按照G B T1 1 2 0 0 9 给出的规则起草。本标准使用重新起草法参考国际种子检验协会(I n t e r n a t i o n a lS e e dT e s t i n gA s s o c i a t i o n，I S T A)的S e e dH e a l t hT e s t i n gM e t h o d s 第7-0 2 3 号标准豌豆中萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的检测编制，与7-0 2 3：2 0 0 8 标准的一致性程度为非等效。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(S A C T C2 7 1)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：林石明、陈青、黄蓬英、易建平、廖富荣、吴媛、陈红运、王宏毅。1 范围萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型检疫鉴定方法G B T2 8 0 7 5-2 0”本标准规定了萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的生物学、血清学和分子生物学的检测鉴定方法。本标准适用于植物种子、苗木等繁殖材料及其产品中萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的检测与鉴定。2 萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型基本信息中文名；萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型(菜豆晕疫病菌)。学名：P s e u d o m o n a ss a v a s t a n o ip v p h a s e o l i c o l a(B u r k h o l d e r，1 9 2 6)G a r d a n，B o l l e t，A b uG h o r r a h G r i m o n t8 LG r i m o n t，1 9 9 2。病害英文名：h a l ob l i g h to fb e a n同物异名：B a c t e r i u mm e d i c a g i n i sv a t p n s z i f o 缸(B u r k h o l d e r)L i n k H u l l，1 9 2 7B a c t e r i u mp u e r a r i a eH e d g e s，1 9 2 7P h y t o m o n a sm e d i c a g i n i s(S a c k e t t)v a r p h a s e o l i c o l aB u r k h o l d e r，1 9 2 6P h y t o m o n a sp u e r a r i a e(H e d g e s)B e r g e ye ta 1，1 9 3 0P 5 e u d o，”o n 口sm e d i c a g i n i sv a r p h a s e o l i c o l a(B u r k h o l d e r)S t a p p&K o t t e，1 9 2 9P s e u d o m o n 口sm e d i c a g i n i sf s p p h a s e o l i c o l a(B u r k h o l d e r)D o w s o n，1 9 5 7P s e u d o m o n a sm e d i c a g i n i sB u r k h o l d e r，1 9 2 6P s e u d o m o n a sp h a s e o l i c o l a(B u r k h o l d e r)D o w s o n，1 9 4 3P s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v p 口s e o Z i c o f 口(B u r k h o l d e r)Y o u n g，D y e W i l k i e，1 9 7 8X a n t h o m o n a sm e d i c a g i n i sv a r 口h a s e o l i c o l a(B u r k h o l d e r)E l l i o t，1 9 5 1属原核生物界P r o c a r y o t e s、变形细菌门P r o t e o b a c t e r i a、卜变形细菌纲G a m m a p r o t e o b a c t e 血、假单胞杆菌目P s e u d o m o n a d a l e s、假单胞杆菌科P s e u d o r n o n a d a c e a e、假单胞杆菌属P s e u d o m o n a s。萨氏假单胞杆菌菜豆生致病型的其他信息参见附录A。3 方法原理依据病菌在培养基上生长的菌落形态、碳源的利用情况、基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(D A 孓E L I s A)、基于体外D N A 合成技术的聚合酶链式反应(P c R)以及病菌接种后的致病特征等进行检测鉴定。4 主要试剂本标准的检测鉴定方法主要使用以下试剂：蛋白胨、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、蔗糖、酪胺酸、甘油、硼酸、头孢氨苄、万古霉素、溴酚蓝、放线(菌)酮或制霉菌素、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、T r i s 一盐酸、E D T A、S D S(十二烷基硫酸钠)、C T A B(十六烷基三甲基溴化胺)、溴化乙锭等P C R 相关试剂。1G B T2 8 0 7 5-2 01 15 主要仪器本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备：超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、培养箱、电子天平、离心机、P C R 仪、电泳仪、凝胶成像系统、B I O L O G 微生物鉴定仪、酶标仪。6 病菌分离6 1 种子样品的制备检查种子表面的为害状与异常情况，感病豆荚的种子可能皱缩，种皮有奶黄色的斑块。每份检测样品至少检测20 0 0 粒种子。根据检测种子样品的质量(g)，按照1：1 5(质量：体积)的比例，在样品种子中加入无菌蒸馏水，如5 0 0g 种子则加入7 5 0m L；于4 5 下静置1 2h 1 8h。取种子浸出液1 0m L，用1 55 5 0 9 离心5r a i n，用蒸馏水分2 次(每次1m L)洗下沉淀物，制成种子浸出液。6 2 种子中病菌的分离培养取1 0 0p L 的种子浸出液涂布于M T 和(或)M S P 培养基平板(培养基的配制见附录B)。每个处理至少3 个5 个重复，无菌水作为空白对照。在2 7 士2 下培养，3d 后开始观察。发现可疑菌落(菌落形态特征见6 4)，将菌落转移至K B平板上培养1d 2d(培养基的配制见附录B)，纯化3 次后进行生化鉴定、或D A S-E L I S A、或P C R 等方法鉴定。6 3 植物组织中病菌的分离培养仔细检查症状(参见图A 7)，用无菌刀片将感染组织切成细的切块，加一滴无菌水置于载玻片上，然后盖上盖玻片在显微镜下观察细菌的菌脓。如有，直接蘸取菌脓，或将菌脓转移入1m L 无菌水中，在M T 和(或)M S P 平板上划线分离(培养基的配制见附录B)。选择新鲜症状的叶片、豆荚等组织，切取病斑前沿部分2m m 7m m 的组织，用7 0 酒精表面消毒1 5s，无菌水洗2 次3 次，在M T 和(或)M S P 平板上培养。在2 7 2 下培养，3d 后开始观察。发现可疑菌落(菌落形态特征见6 4)，将菌落转移至K B平板上培养1d 2d(培养基的配制见附录B)，纯化3 次后进行生化鉴定、或D A S-E L I S A、或P C R 等方法鉴定。6 4 菌落形态特征可疑菌落在K B 培养基上划区培养至少2 0 个菌落，在2 8 下培养2 4h 4 8h，观察有无荧光色素产生，并进行革兰氏染色及鞭毛染色。菌落在以下培养基上产生如下特征，可以确定可疑菌落。在M S P 培养基上：P s p h 菌落圆形、隆起、球形、发亮、淡黄色、中央略浅。3d 后，菌落边缘的培养基变成淡黄色(参见图A 6)。在M T 培养基上：P s p h 菌落奶油状、乳白色、扁平、圆形、直径4 5 m m 5 0 m m；在紫外光下，多数菌落产生淡蓝色的荧光(参见图A 7)。在K B 培养基上：P s p h 的菌落扁平、乳白色和奶油状；3d 后，产生蓝绿色荧光。丁香假单胞杆菌丁香致病型(P s e o n o m o n a ss y m n g a ep v s y r i n g a e)的一些菌株与P s p h 一样，在M S P 培养基上培养3d 后，菌落边缘的培养基也变成淡黄色。但是，P s p h 的菌落边缘不整齐。27 病菌鉴定7 1 生化鉴定采用B I O L O G 微生物鉴定仪对可疑菌落进行生化鉴定。7 2D A S-E L I S A 方法G B T2 8 0 7 5-2 0”将可疑菌落配制成1 0 4c F u m L 悬浮液，取1 0 0p L 悬浮液作为检测样品。每个检测样品重复一次。用已知菌株作阳性对照，用缓冲液作空白对照。具体操作步骤见附录C。7 3P C R 方法将可疑菌落制备成1 0 8 c F u m L 的细菌悬浮液，进行P C R 扩增。或者把可疑菌落转到N B 培养基中(培养基配制见附录B)，在2 5 士2 下振荡培养过夜，离心后提取沉淀的D N A，进行P C R 扩增。用已知菌株作阳性对照，用无菌水作空白对照。具体操作步骤见附录D。7 4 致病性测试7 4 1 概述如果生化鉴定、或D A S-E L I S A、或P C R 方法中一种或一种以上方法的检测结果产生阳性，则进行致病性测试以确认鉴定结果。致病性测定采用以下针刺接种法或浸泡接种法。7 4 2 针刺接种用牙签或解剖针蘸取在K B 培养基上有蓝绿荧光的纯化菌落，在弯颈期的小苗上剌伤接种子叶的近胚轴面。用无菌水接种叶片作空白对照。最少接种1 0 个菌落，每个可疑的菌落接种1 0 株以上小苗，每株接种至少2 个接种点。每次接种前，牙签或解剖针都要消毒。接种4d 5d 后，子叶内部可以见到典型的“油脂”状斑点。如果8d 1 0d 后没有出现症状，则可判定为非致病菌。7 4 3 浸泡接种将感病品种的种子播种在苗床或吸水纸上，保湿，2 5 黑暗条件下培养2d。可疑菌落在K B 上培养1d 2d 后，用无菌水配制成1 0 8C F U m L 的悬浮液。用解剖针挑开已充分吸水种子的子叶和种皮，在悬浮液中浸泡1 0r a i n1 5m i n。每个可疑菌落接种1 0 粒以上种子。设无菌水作空白对照。将浸泡后的种子种植在无菌的土壤中，2 0 下高湿培养5d 7d。种子萌发后，在子叶上出现“油脂状”的斑点，第一真叶也可能出现症状。如果8d 1 0d 后没有出现症状，则可判定为非致病菌。8 结果判定与检测报告8 1 结果判定8 1 1 未分离到可疑菌落如果经M T 或M S P 培养基分离培养，7d 后仍未产生可疑菌落，则未检出萨氏假单胞杆菌菜豆生3G B T2 8 0 7 5-2 011致病型。8 1 2 分离到可疑菌落分离培养后的可疑菌落，应经生化鉴定、或D A S-E L I S A 或P C R 方法检测，并通过致病性测试的确认：如果生化鉴定、或D A S-E L I S A、或P C R 检测中一种或一种以上方法的结果为阳性，致病性测试也产生典型症状，则判定为阳性，