GBT 27639-2011 结核病病原菌实时荧光PCR检测方法.pdf

I C S1 1 2 2 0B4 1a 园中华人民共和国国家标准G B T2 7 6 3 9-2 01 1结核病病原茵实时荧光P C R 检测方法R e a l t i m eP C Rm e t h o df o rt h ed e t e c t i o no ft u b e r c u l o s i sp a t h o g e n i co r g a n i s m s2 0 11-1 2-3 0 发布2 0 1 2-0 4-0 1 实施宰瞀鹊鬻瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅1 9刖吾G B T2 7 6 3 9-2 01 1本标准按照G B T1 1 2 0 0 9 给出的规则起草。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(S A C T C1 8 1)归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、华中农业大学、中国检验检疫科学研究院、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人：陈茹、刘中勇、杨国海、郭爱珍、曾碧健、韩雪清、高小博、林祥梅、吴晓薇。1 范围结核病病原菌实时荧光P C R 检测方法G B T2 7 6 3 9-2 0 11本标准规定了结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌实时荧光P C R 检测方法的技术要求和操作规范。本标准适用于快速检测细菌培养物、血样、奶样、痰液、组织器官、粪便等临床样品中结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B T6 6 8 2-2 0 0 8 分析实验室用水规格和试验方法G B1 9 4 8 9-2 0 0 8 实验室生物安全通用要求3 缩略语下列缩略语适用于本文件。c t 值：荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。d N T P：d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e，脱氧核苷三磷酸。D M S o：d i m e t h y ls u l f o x i d e，二甲基亚砜。E D T A：e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d，乙二胺四乙酸。P B S：p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n，磷酸盐缓冲液。P C R：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n，聚合酶链式反应。T a q 酶：T a qD N A 聚合酶。U D G 酶：u r a c i lD N Ag l y c o s y l a s e，尿嘧啶D N A 糖基化酶。4 原理本标准方法采用了T a q M a n 探针实时荧光P C R 技术原理。反应体系中包括一对用于扩增D N A的引物，和一条能与P C R 产物特异杂交的荧光标记探针。探针的5 端标记了被称为报告基团的荧光素，3 端标记了淬灭基团。在进行P C R 延伸反应时，T a q 酶的5 外切酶活性将5 端荧光基团从探针上切割下来，使其与淬灭基团分离，从而仪器能检测到5 端荧光基团所发出的荧光信号，一分子P C R 扩增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生。随着扩增循环次数的增加，仪器检测判的荧光信号的累积反应了扩增产物量的变化。本标准提供特异检测结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌共四套实时荧光P C R 检测方法(见表1)。其中，结核分枝杆菌复合群特异的实时荧光P C R 方法分别以I S 6 1 1 0、I S l 0 8 1 插入基因序列为模板设计特异扩增引物与探针；结核分枝杆菌、牛分枝杆菌特异的实时荧光P c R 方法分别以菌种特异的基因组序列为模板设计特异扩增引物与探针。】G B T2 7 6 3 9-2 01 1表1 荧光P C R 引物与探针序列类别核酸序列上游引物：5 G c AG G GT T CG C CT A CG T G3 结核分枝杆菌复合下游引物：5 C G GG T CC A GA T GG C TT G C3 群(I S 6 1 1 0)探针：5 L F A M-T G TC A CC G AC G CC T AC G CT C GC3 L B H Q l上游引物：5 C C AG G AA c GC C TC A AC C3 结核分枝杆菌复舍下游引物：5 C G AC G AG G CG G AT G AT C3 群(I S l 0 8 D探针：5，一F A M-A G AG G TA C GA C GC C GA A CC G AC B F I Q-1上游引物：5 C G GT G TA A TC A GT T TT G AA G C3 结核分枝杆菌下游引物：5 C G AT T GG A AC G GC G AA G C3 探针：5 一F A M T A GG T AG T CC A GT A GA G CC C CA T AG C CA3 一B H C 卜1上游引物：5 A C GC C TT C CT A AC C AG A AT T G3 牛分枝杆菌下游引物：5 G G CT A TT G AC C AG C TA A GA T AT C C3 探针：5 一F A M-A A TT C AT A CA A GC C GT A GT C GT G CA G AA3 L B H q-15 探针5 端标记的报告荧光基团及3，端标记的淬灭基团可根据荧光P C R 仪设备等具体情况另行选定。5 材料与试剂5 1 仪器与耗材5 1 1 接种棒。5 1 2 无菌注射器或真空采血管。5 1 3 灭菌容器。5 1 4 橡胶管。5 1 5 刮匙。5 1 6 级生物安全柜。5 1 7 荧光P C R 仪。5 1 8 恒温水浴锅(室温至1 0 0)。5 1 9 离心机(最高离心力达1 50 0 0 g 以上)。5 1 1 0 混匀器。5 1 1 1 冰箱(2 8，一2 0，一8 0)。5 1 1 2 天平(精密度达千分之一以上)。5 1 1 3 微量可调移液器(1 0p L，1 0 0p L，10 0 0p L)。5 1 1 4 微量带滤芯吸嘴(1 0p L，1 0 0 p L，10 0 0p L)。5 1 1 5 研钵。5 1 1 6 离心管。5 1 1 7P C R 光学反应管。5 2 试剂5 2 1 试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合G B T6 6 8 2-2 0 0 8 规定的二级水，所用化学试2C S T2 7 6 3 9-2 0 1 1剂均为分析纯。5 2 2 引物与探针：采用无D N A 酶、无R N A 酶水将每条引物与探针(序列见表1)配制成1 0 0t t m o l L储存液，置-2 0 或更低温度冻存；使用时取适量配制成1 0t t m o l L 工作液，避免多次冻融。5 2 30 0 1 m o l LP H 7 6P B S：配方见A 1。5 2 4 柠檬酸钠缓冲液：配方见A 2。5 2 50 5m o LE D T A：配方见A 3。5 2 6 柠檬酸钠一磷酸缓冲液：配方见A 4。5 2 74 氢氧化钠溶液：配方见A 5。5 2 84 硫酸溶液：配方见A 6。5 2 9T r i t o nX-1 0 0。5 2 1 0D N A 提取液：含1 0 0 m m o l L T r i s H C l(p H 8 o)，0 0 1 T r i t o n X-1 0 0，2 0 0 F g o L 蛋白酶K。也可采用等效商品化试剂。5 2 1 1 灭菌双蒸水。5 2 1 2 三氯甲烷。5 2 1 3 异丙醇。5 2 1 4 无水乙醇。5 2 1 57 0 乙醇：用新开启的灭菌双蒸水配制，-2 0 预冷。5 2 1 6 荧光P C R 反应缓冲液：含5 0m m o l LK C I，1 0m m o l LT r i s-H C l(p H 8 3)，2 5m m o l LM g C l。，5 二甲基亚砜(D M s O)，5 甘油。可采用等效商品化试剂。5 2 1 7d N T P：d A T P、d U T P、d C T P 和d G T P。5 2 1 8T a q 酶。5 2 1 9U D G 酶。6 生物安全要求采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守G B1 9 4 8 92 0 0 8 的有关规定。7 采样7 1 样品采集7 1 1 细菌培养物直接取液体培养基培养的菌液 对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量(取用量达到肉眼可见，菌团大小不超过接种环)菌样，放到0 0 1m o l Lp H 7 6P B S 中，振荡混匀形成悬浮菌液。7 1 2 血样用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，无菌分离血清，用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，将血液直接滴人抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或0 5 m o l L E D T A。每6 m L 血液加1 m L 抗凝剂。条件允许时，建议优先采集全血，以更有利于富集菌体。7 1 3 奶样无菌采集奶液于灭菌的容器中。一般以后段奶液含菌量较多，早晨挤出的奶液含菌量最高。3G B T2 7 6 3 9-2 0117 1 4 痰液动物痰液采集：动物咯痰极少，宜在清晨采集，用橡胶管自口腔伸人至气管内，外接注射器吸取痰液。亦可取咳出的痰块。人痰液采集：采集清晨从肺深处咳出的痰液。用灭菌容器密闭送检。7 1 5 组织器官采集动物下颌、咽后、支气管、肺(特别是肺门及肺门淋巴结)、纵隔和肠系膜淋巴结，以及病变组织器官如肝、睥、肺等。7 1 6 粪便采集混有粘液、血液、粘膜的粪便，或用刮匙从动物直肠深部(约3 0c m)取少量粘液粪便，盛于灭菌容器中。7 2 样品的保存和运输待检样品在2-8 保存不应超过2 4h；一2 0 保存不超过三个月；一8 0 以下长期保存。样品应置于低温、密封的容器内运输。8 荧光P C R 操作方法8 1 样品前处理8 1 1 血样、细菌培养物(蓖液)前处理取1 m L 2 m L 全血样品，1 50 0 0 X g 离心1 0 m i n，弃上清；加等体积灭菌双蒸水充分振荡，1 50 0 0 g离心1 0r a i n；弃上清，若红血球裂解不完全，需采用灭菌双蒸水重复洗涤；收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一2 0 贮存备用。取1 m L 2 m L 血清、菌液样品，1 50 0 0 g 离心1 0r a i n，弃上清，加1 m L0 0 1 m o l Lp H 7 6P B S，充分振荡混匀，1 50 0 0 g 离心1 0r a i n；弃上清，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置-2 0 贮存备用。8 1 2 奶样前处理取1 0 m L 奶液，加1 0 0p L T r i t o n X 一1 0 0，振荡混匀，25 0 0 g 离心2 0 r a i n；弃上清，取沉淀，加1 m L0 0 1 m o l Lp H 7 6P B S，充分振荡混匀；将沉淀悬浮液移入微量离心管，1 50 0 0 g 离心1 0 r a i n；弃上清，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置-2 0 贮存备用。8 1 3 痰液前处理在痰液样品中加入2 倍4 倍体积4 氢氧化钠溶液，振荡混匀，室温放置3 0r a i n，问或振荡混匀，使其充分液化(无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加入少量4 氢氧化钠溶液直至液化完全)；1 50 0 0 g 离心1 0m i n；弃上清，加lm L0 0 1m o l Lp H 7 6P B S，充分振荡混匀，1 50 0 0 X g 离心1 0 r a i n，弃上清，重复本步骤1 次；收集沉淀物，继续进