GBT 28080-2011 小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法.pdf

I C S6 5 0 2 0 0 1B1 6a 雪中华人民共和国国家标准G B T2 8 0 8 0-2 01 1小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法D e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fT l l e t i ai n d i c aM i t r a2 0 1 卜1 2 3 0 发布2 0 1 2-0 6-0 1 实施宰瞀徽鬻瓣訾糌瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会厘1 1 1G B T2 8 0 8 0-2 011目次前言I1 范围12 规范性引用文件13 小麦印度腥黑穗病菌基本信息14 方法原理15 检疫鉴定流程16 取样方法36 1 未经加工小麦取样方法36 2 加工小麦取样方法36 3 袋装面粉抽样比例37 主要仪器设备和试剂。37 1 主要仪器设备一37 2 主要试剂48 检测与鉴定48 1 样品前处理48 2 形态学鉴定58 3 单个冬孢子直接分子检测58 4 孢子培养物的分子检测58 5 序列测定与比对59 结果判断与表述59 1 形态学鉴定结果判断和表述59 2 单个孢子直接分子检测结果判断和表述59 3 孢子培养物分子检测结果判断和表述69 4 序列测定与比对。61 0 样品和原始数据保存61 0 1 样品保存一61 0 2 原始数据保存6附录A(资料性附录)小麦印度腥黑穗病菌其他信息7附录B(规范性附录)形态学鉴定一9附录C(资料性附录)小麦印度腥黑穗病菌与近似种的孢子显微形态图和扫描形态图1 0附录D(规范性附录)单个冬孢子直接分子检测1 2附录E(规范性附录)孢子培养物常规P C R 检测1 4附录F(规范性跗录)孢子培养物实时荧光P C R 检铡1 6附录G(规范性附录)序列测定与比对1 8刖罱G B T2 8 0 8 0-2 01 1本标准按照G B T1 1 2 0 0 9 给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(S A C T C2 7 1)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深：Or f 出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：章桂明、程颖慧、王颖、陆清、凌杳元、龙海、陈枝楠、向才玉、杨伟东、缪建锟。1 范围小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法G B T2 8 0 8 0-2 0 11本标准规定了小麦印度腥黑穗病菌的检疫鉴定方法，包括形态学方法和分子生物学检测方法，规定了小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定流程，明确了取样和样品保存方法。本标准适用于小麦及其加工产品传带的小麦印度腥黑穗病菌的检测。本标准也适用于除小麦以外的该病菌其他寄主传带小麦印度腥黑穗病菌的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B T6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B T1 8 0 8 5 植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法G B T1 9 4 9 5 2 转基因产品检测实验室技术要求3 小麦印度腥黑穗病菌基本信息中文名：小麦印度腥黑穗病菌。学名：T i l l e t i ai n d i c aM i t r a。异名：N e o v o s s i ai n d i c a(M i t r a)M u n d k u r。病害英文名：k a r n a lb u n to fw h e a t(简称K B)，p a r t i a lb u n to fw h e a t。属真菌界F u n g i、担子菌门B a s i d i o m y c o t a、黑粉菌纲U s t o m y e e t e s、黑粉菌目U s t i l a g i n a l e s、腥黑粉菌科T i l l e t i a e e a e、腥黑粉菌属T i l l e t i a。小麦印度腥黑穗病菌主要通过发病种子和附着于健康种子表面的冬孢子进行远距离传播，也可随土壤及其他农用工具进行传播。小麦印度腥黑穗病菌的其他信息参见附录A。4 方法原理根据小麦印度腥黑穗病菌的生物学和形态学特征以及分子生物学特征，应用相关仪器，包括显微镜和P C R 仪等对小麦印度腥黑穗病菌进行鉴定。5 检疫鉴定流程检疫鉴定流程见图1。G B T2 8 0 8 0-2 0112图1小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定流程图6 取样方法C B T2 8 0 8 0-2 0”6 1 未经加-T-d、麦取样方法按照G B T1 8 0 8 5 取样方法进行取样。6 2 加工小麦取样方法实施堆垛抽样时，在堆垛四周按正弦曲线从上、中、下层随机确定抽样点。实施船舱内货物抽样时，以5 0m 2 为一个抽样区，每区设中心及四角(距边缘1m 处)五个抽样点每增加一个抽样区，增加三个抽样点。集装箱或车厢装载的麦麸、面粉抽样参照船舱抽样方法进行。6 3 袋装面粉抽样比例1 0 袋以下，逐袋抽样。i 0 1 0 0 袋，随机取1 0 件。1 0 0 袋以上，按一批货物总袋数的平方根数抽取见式(1)。n 一俩式中：一批货物的总袋数；n 应抽取件数(n 值取整数，小数部分向上修约)。7 主要仪器设备和试剂7 1 主要仪器设备7 1 1 摇床。7 1 2 显微镜。7 1 3 纯水器。7 1 4 测序仪。7 1 5 电泳仪。7 I 6 低温冰箱。7 1 7 显微操作仪。7 1 8 超净工作台。7 1 9 高压灭菌锅。7 I 1 0 光照培养箱。7 1 1 1 旋涡振荡器。7 1 1 2 普通离心机。7 1 1 3 冷冻干燥机。7 1 1 4 凝胶成像仪。7 1 1 5 核酸蛋白分析仪。7 1 1 6P C R 仪(常规P C R 仪、实时荧光P C R 仪)。7 1 1 7 破壁针(具有平截切面的针，能将孢子压碎)。7 1 1 8 培养皿(9c m)。G B T2 8 0 8 0-2 0 1 17 1 1 97 1 2 07 1 2 17 1 2 27 1 2 37 1 2 47 1 2 57 1 2 6筛网(5 3p m、2 0p m)。孔径1 0 0p m 的毛细管。锥形瓶(2 5 0m L、5 0 0m L)。盖玻片(1 8m i l l 1 8m m)。P C R 反应管(O 2 m L，0 5 m L)。载玻片(2 5 m m 7 6 m m，厚(O 8 m m 1 0 m m)。T i p 头(0 1b t L 1 0F L，5 弘L 2 0 0 卜L，1 0 0b t L l0 0 0b t L)。可调微量移液器(2p L，1 0p L，2 0p L，1 0 0p L，2 0 0p L，10 0 0p L)。7 2 主要试剂7 2 1 三氯甲烷。7 2 2 异戊醇。7 2 3 异丙醇。7 2 4 醋酸钠。7 2 5 甲酰胺。7 2 67 0 乙醇。7 2 7 无水乙醇。7 2 8T r i s 饱和酚。7 2 9T a q 酶。7 2 1 0G e l a t i n。7 2 1 1 溴化乙锭。7 2 1 2D N AM a r k e r。7 2 1 3P D A 培养基。7 2 1 4 水琼脂培养基。7 2 1 5S D S 提取液。7 2 1 6P C R 缓冲液。7 2 1 7 电泳缓冲液。7 2 1 8 上样缓冲液。7 2 1 9B i g d y e 试剂盒。7 2 2 0T a q M a nU n i v e r s a lP C RM a s t e rM i x。7 2 2 1 席尔氏浮载剂，见G B T1 8 0 8 5。7 2 2 2d N T P s(d A T P、d G T P、d C T P、d T T P)。洼：赊另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。8 检测与鉴定8 1 样品前处理8 1 1实验室器皿和筛网的前处理将所有实验器皿和筛网浸泡于1 6 的次氯酸钠中1 5m i n，然后用无菌水冲洗5 次。8 1 2 面粉中孢子的获取将面粉样品充分混匀，称取5 0 9 置于2 5 0 m L 锥形瓶中，加入1 0 0 m L 无菌水，搅拌均匀后倒人直径4G B T2 8 0 8 0-2 0 1 1为9C I T 的玻璃培养皿中，使面粉溶液在培养皿中均匀成一薄层，再将培养皿置于解剖镜下镜检，用解剖针挑取深色冬孢子用于形态学鉴定或分子生物学检测。8 2 形态学鉴定对查找到菌瘿，或通过洗涤检验获得冬孢子的，先进行形态学鉴定。对菌瘿采用解剖针挑取菌瘿的冬孢子，置于席尔氏液中制片，对洗涤检验采用滴管吸取冬孢子悬浮液制片，待冬孢子胶质鞘充分展开后，进行封片，观察冬孢子的大小、形状、颜色、外孢壁结构，在1 0 0 油镜下测量冬孢子的大小，每个样品测量1 0 0 个冬孢子。形态学鉴定的具体操作过程见附录B，K B 与近似种的形态学图参照附录C。8 3 单个冬孢子直接分子检测对未查找到菌瘿，但通过洗涤检验发现疑似小麦印度腥黑穗病菌冬孢子的，要进行单个孢子分子方法检测。每个P C R 反应检测1 个冬孢子，共检测5 个冬孢子。每次P C R 检测应设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。单个冬孢子直接分子检测具体操作过程见附录D。8 4 孢子培养物的分子检测对未查找到菌瘿，但通过洗涤检验发现疑似小麦印度腥黑穗病菌，而这些疑似小麦印度腥黑穗病菌通过形态学和单个孢子检测无法获得准确结果时，则要对孢子进行培养(培养方法见E 1)，用培养物进行分子检测。每次P C R 检测须设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。孢子培养物分子检测具体操作过程见附录E、附录F。8 5 序列测定与比对将P C R 产物纯化后，进行测序，或由生物公司完成。把测序所得到的核苷酸序列与已知的小麦印度腥黑穗病菌相应序列进行比对。序列比对具体操作过程见附录G。9 结果判断与表述9 1形态学鉴定结果判断和表述对查找到的菌瘿中的冬孢子或通过洗涤检验获取的冬孢子，所观察的症状和形态学特征与小麦印度腥黑穗病菌冬孢子的一致，且对其1 0 0 个孢子大小测量平均值大于3 5p m，则判定该样品含有小麦印度腥黑穗病菌；对其1 0 0 个孢子大小测量平均值小于2 5p m，则判定该样品不含有小麦印度腥黑穗病菌；对其1 0 0 个孢子大小测量平均值介于2 5p m 3 5$z m，则判定该样品含有疑似小麦印度腥黑穗病菌，应进行进一步分子检测。9 2 单个孢子直接分子检测结果判断和表述9 2 1常规P C R 检测结果判断和表述对单个孢子进行P C R 检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，如通过电泳获取2 6 0b p 条带，且测序比对与小麦印度腥黑穗病菌一致的判定为该样品含有小麦印度腥黑穗病菌；如没有P C R 扩增条带的则应挑取孢子进行萌发，进行分子检测。G B T2 8 0 8 0-2 01 19 2 2 实时荧光P C R 检测结果判断和表述对单个孢子进行M G B 探针实时荧光P C R 检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则：检测c t 值小于或等于3 6，判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性；检测C t 值大于3 6，应重做实时荧光P C R，如再次扩增后，C t 值小于或等于3 6，判定同上，如C t值大于3 6，则需要挑取冬孢子进行萌发，用孢子培养物进行分子检测。9 3 孢子培养物分子检测缔果判断和表述9 3 1常规P C R 检测结果判断和表述对孢子培养物进行常规P C R 检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，如样品扩增产生4 1 4b p(引物T i n 3 T i n 4)或2 6 0b p(引物P 1 2)的特异性条带，则初步判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性，但需进一步进行实时荧光P C R 检测或序列测定与比对进行结果验证，按照实时荧光P C R 检测或序列测定与比对结果进行最后结果判定；如样品无特异性扩增条带，则判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阴性。9 3 2 实时荧光