GBT 28073-2011 南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

I C S6 5 0 2 0 0 1B1 6a 亘中华人民共和国国家标准G B T2 8 0 7 3-2 01 1南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法D e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i O no fa r a b i sm o s a i cv i r u s2 0 11 1 2 3 0 发布2 0 1 2-0 6-0 1 实施宰瞀鳃鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会“”。刖置G B T2 8 0 7 3-2 01 1本标准按照G B Tl _ 1 2 0 0 9 给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(S A C T C2 7 1)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标准主要起草人：廖富荣、于翠、张永江、陈红运、林石明、陈青、黄蓬英、沈建国、吴嫒。1 范围南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法G B T2 8 0 7 3-2 0 11本标准规定了南芥菜花叶病毒血清学和分子生物学的检测鉴定方法。本标准适用于植物种子、鳞球茎、苗木和组培苗等植物及其产品中南芥菜花叶病毒的检测与鉴定。2 南芥菜花叶病毒基本信息中文名：南芥菜花叶病毒。英文名：a r a b i sm o s a i cv i r u s。异名：a r a b i sm o s a i cn e p o v i r u s；h o pn e t t l e h e a dv i r u s(啤酒花荨麻病病毒)；r h u b a r bm o s a i cv i r u s(大黄花叶病毒)；r a s p b e r r yy e l l o wd w a r fv i r u s(悬钩子黄矮病毒)；a s hr i n ga n dl i n ep a t t e r nv i u r s(白腊树环线状病毒)；r h a b a r b e r-m o s a i k-v i r u s(大黄花叶病毒)；f o r s y t h i ay e l l o wn e tv i r u s(连翘黄网状病毒)；j a s m i n ey e l l o wb l o t c hv i r u s(茉莉黄斑病毒)。英文缩写：A r M V。属豇豆花叶病毒科C o m o v i r i d a e，线虫传多面体病毒属N e p o v i r u s。南芥菜花叶病毒的其他信息参见附录A。3 方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(D A S _ E L I s A)、反转录和体外D N A 扩增技术的反转录聚合酶链式反应(R T-P c R)进行检测鉴定。4 主要仪器设备本标准的检测鉴定方法主要使用以下仪器设备：微量榨汁机、酶标仪、洗板机、微量天平(感量：0 0 0 1g)、P C R 仪、荧光P C R 仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、p H 计等和各种量程的可调移液器(10 0 0p L、2 0 0p L、1 0 0p L、2 0p L、l O l L、2p L)。5 检测与鉴定5 1D A s _ E L I S A 检测把0 5g 1 0g 样品充分研磨或在液氮中研磨，按1：1 0 比例加入样品提取缓冲液，转移到5m L离心管中，80 0 0r m i n 离心5m i n，上清液作为D A S _ E L I S A 的检测提取液。设置阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照的种类和材料(如：种子或叶片)应该尽量与所检测样品类型相一致。具体操作过程见附录B。注：提取液在3h 内使用，否则保存在4 中。】G B T2 8 0 7 3-2 01 15 2R T-P C R 检测分别提取检测样品的总R N A，然后用R T-P C R 检测。用健康的植物组织作阴性对照，用感染A r M V 的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作过程见附录c。5 3 实时荧光R T-P C R 检测分别提取检测样品的总R N A，反转录合成c D N A 后用实时荧光P C R 检测。用健康的植物组织作阴性对照，用感染A r M V 的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作过程见附录D。5 4 序列测定将P C R 产物回收后，进行克隆、测序，或者直接测序，测序可由生物公司完成。把测序所得到的核苷酸序列与已知的A r M V 相应序列进行比对，如果翻译后氨基酸序列与已知的A r M V 相应序列同源性大于7 5 则判定为A r M V 序列，小于7 5 则判定为非A r M V 序列。注：序列比对可利用N C B I 网站上的B L A S T 软件进行，网址为h t t p：w w w n c b i n l m n i h g o v B L A S T 6 结果判定与报告6 1 结果判定当产生以下检测结果时，则判定为检出A r M V：当D A S-E L I S A 检测、R T-P C R 检测、实时荧光R T P C R 检测，其中有两种方法检测结果呈阳性时，判定为检出A r M V；当R T-P C R 检测结果呈阳性，测定的序列为A r M V 序列，则判定为检出A r M V。6 2 结果记录与保存记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。血清学检测结果保存吸光值的数据报告，R T P C R 检测结果保存电泳照片，实时荧光R T P C R 检测结果保存采集的数据，序列测定结果保存测序报告图。A 1 分布附录A(资料性附录)南芥菜花叶病毒简介G B T2 8 0 7 3 2 0 1 1欧洲：奥地利、白俄罗斯、比利时、保加利亚、塞浦路斯、捷克共和国、丹麦、芬兰、法国、德国、匈牙利、爱尔兰、意大利、拉脱维亚、立陶宛、卢森堡公国、摩尔多瓦、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、斯洛文尼亚、瑞典、瑞士、英国、乌克兰和南斯拉夫。亚洲：日本、哈萨克斯坦、土耳其、伊朗。非洲：南非。北美洲：加拿大、美国。大洋洲：澳大利亚、新西兰。A 2 形态特征该病毒属线虫传多面体病毒，病毒粒体为等轴对称二十面体，直径约3 0n m，为双分体病毒，含有两条相对分子质量分别为2 4 X 1 0 6 和1 4 1 0 6 的单链R N A。超速离心后分为T(5 3 S)，M(9 3 S)和B(1 2 6 S)三个组分。该病毒具有一个外壳蛋白，相对分子质量为5 4k D a。A 3 寄主范围及症状A r M V 可侵染1 7 4 属2 1 5 种植物。主要为害的作物有大麻(C a n n a b i ss a t i v a)、啤酒花(H u m u l u sl u p u l u s)、黄瓜(C u c u m i ss a t i v u s)、西葫芦(C u c u r b i t ap e p o)、莴苣(L a c t u c as a t i v a)、草莓(F r a g a i aa n a n a s s a)、葡萄(V i t i sv i n i f e r a)、香石竹(D i a n t h u sc a r y o p h y l l u s)、水仙(N a r c i s s u st a z e t t a)、蔷薇(R o s am u l t i f l o r a)、草木樨(M e l i l o t u ss u a v e o l e n s)、郁金香(T u l i p ag e s n e r i a n a)、芹菜(A p i u mg r a v e o l e n s)、薄荷(M e n t h as p p i p e r i t a)、丁香(S y r i n g ao b l a t a)、大豆(G l y c i n em a x)、甜菜(B e t av u l g a r i s)、马铃薯(S o l a n u m t u b e r o s m)、烟草(N i c o t i a n at a b a c u m)、番茄(L y c o p e r i c o ne s c u l e n t u m)、菜豆(P h a s e o l H sv u l g a r i s)、豇豆(V i g n au n g u i c u l a t a)、蚕豆(V i c i a 知b a)、豌豆(P i s u ms c a t w u m)、甜瓜(C M c u m i sm e l o)、花椰菜(B r a s s i c ao l e r a c e aL v a r b o t r y t i s)、菠菜(S p i n a c i ao l e r a c e a)、胡萝h(D a u c u sc a r o t a)等。A r M V 引起的最常见症状是叶片斑驳和脱落、植株矮化、严重畸型、耳突。症状随着寄主植物、病毒的分离物、栽培条件、季节和年份的不同而改变。有时候A r M V 的侵染是臆症的，并不会在寄主植物上表现症状。在鉴别寄主上产生的症状：a)昆诺藜(C h e n o p o d i u mq u i n o a)和苋色藜(c a m a r a n t i c o l o r)接种叶上形成褪绿的局部斑点，然后形成系统性斑驳；b)黄瓜(c s a t i v u s)：接种的子叶上产生褪绿的局部斑点，以及系统性脉带或黄色斑点；c)菜豆(P v u l g a r i s)：产生坏死的局部枯斑、系统性坏死和畸型；d)矮牵牛(P e t u n i ah y b r i d a)：产生局部坏死斑点或小的坏死环和系统性环斑，以及线状斑或明脉。3G B T2 8 0 7 3-2 01 1然而，并不是所有株系能够产生这些明显区别的症状，如啤酒花株系(A r M V-H)就不能产生这些明显的症状。另外，A r M V 经常与草莓潜隐环斑病毒(s t r a w b e r r yl a t e n tr i n g s p o tv i r u s，S L R V)等病毒混合侵染，从而产生更加复杂的症状。因此，使用鉴别寄主进行鉴定时，还需结合其他方法，如D A S-E L I S A 等。A 4 传播途径A r M V 主要通过汁液摩擦接种，种苗传播也很普遍，也可通过介体线虫传播。通过种子传播的寄主：莴苣(L s a t i v a)、松草莓(F a n a n a s s a)、大豆(G m a x)、甜菜(B v u l g a r i sv a r s a c c h a r i f e r a)、番茄(L e s c u l e n t u m)等。通过块茎传播的寄主：马铃薯(s t u b e r o s m)等。通过鳞球茎传播的寄主：水仙(N t a z e t t a)、郁金香(T u l i p ag e s n e r i a n a)、百合(L i l i u mb r o w n i iv a r c o l c h e s t e r i)等。通过苗木传播的寄主：葡萄(V v i n i f e r a)、草莓(F a n a n a s s a)、啤酒花(H 1 u p u l u s)、香石竹(D c a r y o p h y l l u s)、蔷薇(R m u l t i f l o r a)等。传播介体主要为异尾剑线虫(X i p h i n e m ad i v e r s i c a u d a t u m)。A 5 血清学特性A r M V 具有很强的免疫原性，提纯的病毒免疫兔子后，可以制备出高质量的抗血清。A r M V 抗血清与烟草环斑病毒(t o b a c c or i n g s p o tv i r u s，T R s V)、番茄环斑病毒(t o m a t or i n g s p