GBT 27623.1-2011 渔用抗菌药物药效试验技术规范 第1部分：常量肉汤稀释法药物敏感性试验.pdf

I C S1 1 2 2 0B5 0缮亘中华人民共和国国家标准G B T2 7 6 2 3 1 2 0 1 1渔用抗菌药物药效试验技术规范第1 部分：常量肉汤稀释法药物敏感性试验P h a r m a c o d y n a m i ct e s tt e c h n i c a ls p e c i f i c a t i o nf o ra q u a c u l t u r ea n t i m i c r o b i a la g e n t-P a r t1：A n t i b i o t i c ss u s c e p t i b i l i t yt e s to fm a c r o-b r o t hd i l u t i o nm e t h o d2 0 11-1 2-3 0 发布2 0 1 2-0 4-0 1 实施宰瞀鹊鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会促1 1 1刖昌G B T2 7 6 2 3(渔用抗菌药物药效试验技术规范分为两个部分一第1 部分：常量肉汤稀释法药物敏感性试验；一第2 部分：人工感染防治试验。本部分为G B T2 7 6 2 3 的第1 部分。本部分按照G B T1 1 2 0 0 9 给出的规则起草。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会(S A C T C1 5 6)归口。本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所。本部分主要起草人：刘淇、李健、王群、戴芳钰。G B T2 7 6 2 3 1 2 0 111 范围渔用抗茵药物药效试验技术规范第1 部分：常量肉汤稀释法药物敏感性试验G B T2 7 6 2 3 1 2 0 1 1G B T2 7 6 2 3 的本部分规定了渔用抗菌药物的常量肉汤稀释法药物敏感性试验所需的试剂和材料、仪器设备、操作步骤和质量控制。本部分适用于渔用抗菌药物的常量肉汤稀释法药物敏感性试验。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B T6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法中华人民共和国兽药典(2 0 1 0 年版)中华人民共和国农业部公告第1 5 2 1 号3 试剂和材料3 1 化学试剂除非另有说明，本部分使用确认为分析纯的化学试剂。3 2 实验用水除非另有说明，应符合G B T6 6 8 2 中三级水的规格。3 3M u e l l e r-H i n t o n 琼脂(M-H 琼脂)培养基按产品说明用干粉培养基制备平板，其中用于弧菌试验的M H 琼脂培养基中需添加1 5 的氯化钠。3 4M u e l l e r-H i n t o n 肉汤(M-H 肉汤)培养基按产品说明用干粉培养基制备M H 肉汤，其中用于弧菌试验的M-H 肉汤培养基需添加氯化钠至终浓度为1 5。每一批M-H 肉汤培养基的p H 值在室温下应为7 2 7 4，应含有2 0 m g L 2 5 m g LC a 2+和1 0m g L 1 2 5m g LM g“。如果采用原子吸收光谱法等方法测得培养基C a 2+和M 9 2+含量不够时，应向培养基中添加适量无菌的c a 2+和M 9 2+溶液(镁离子和钙离子溶液的制备方法见附录A)；添加了C a”和M g”的M H 肉汤培养基不可再次高压灭菌。3 50 8 5 无菌生理盐水称取8 5 0g(精确到0 0 1g)分析纯氯化钠，加入1L 蒸馏水溶解后1 2 1 1 5r a i n 高压灭菌。G B T2 7 6 2 3 1 2 0”3 6 实验菌株3 6 1 实验菌株应选用来自国家级微生物菌种保藏中心的标准致病菌株或具有资质的菌种保藏机构提供的分类地位明确的致病菌株，也可以使用临床分离的致病菌株，使用I 晦床分离的致病菌株时应至少鉴定至属。其中质控菌株为荧光假单胞菌(A S l 1 8 0)和副溶血弧菌(A S l 1 6 1 4)，质控菌株应来自国家级微生物菌种保藏中心或具有资质的菌种保藏机构。3 6 2 日常使用的质控菌株荧光假单胞菌应在M-H 琼脂上，副溶血弧菌应在添加1 5 氯化钠的M H 琼脂上于4 8 的冷藏箱中保存；质控菌株的使用代次为3 代1 4 代；质控菌株应至少一个月更换一次，由冻干或超低温冷冻保存菌种移种或购买新菌种。3 7 质控药物：盐酸土霉素，含量9 5 以上，应符合中华人民共和国兽药典(2 0 1 0 年版)要求。4 仪器设备4 1 恒温箱：可满足2 8 士1。4 2移液器：量程4 0p L 2 0 0 z L、1 0 0 弘L 10 0 0 弘L、10 0 0p L 50 0 0 z L。4 3 无菌操作台：可满足无菌要求的洁净工作台、生物安全柜或无菌室等。4 4 分析天平：精确至1 m g。5 操作步骤5 1 抗菌药物母液的制备5 1 1 抗菌药物母液的浓度抗菌药物母液的浓度应至少为最高测试浓度的1 0 倍，但对于某些溶解性低的抗菌药物可以制备较低浓度的母液。5 1 2 溶剂和稀释液用于制备抗菌药物母液的溶剂和稀释液见附录B。除蒸馏水可高压灭菌外，其余应采用0 2 2p m微孔滤膜过滤除菌。5 1 3 母液的制备称取不低于0 1 0g 抗菌药物，精确到1m g；在无菌条件下使用5 1 2 中溶剂和稀释液配制抗菌药物母液。5 2 抗菌药物药液浓度的建立抗菌药物药液的浓度按倍比稀释来建立，试验要在无菌条件下于适宜的玻璃试管中进行。试验中取1 0 支试管排成一列，在第1 管中加入适量的渔用抗菌药物母液和M-H 肉汤(总体积以2m L 1 0m L为宜)，使其浓度为试验的最高浓度。第2 1 0 管均加入第1 管总体积二分之一的M H 肉汤。第1 管混匀后取二分之一的量加入第2 管中，混匀后从第2 管中取二分之一的量加入第3 管中，依次类推到第8 管，混匀后第8 管吸取二分之一的量弃掉，第9、1 0 管不加药物，第9 管作为细菌生长情况对照，第1 0 管作为无菌控制对照。2G B T2 7 6 2 3 1 2 0 1 15 3 菌液接种5 3 1 起始培养菌落接种的菌落由新鲜的M H 琼脂培养基平板划线待测菌的单菌落来制备，孵育温度为2 8，除非是缓慢生长菌株，否则平板培养时间不应超过2 4h。5 3 2 接种菌液的制备接种菌液通过在0 8 5 无菌生理盐水中，乳化至少3 个起始培养单菌落来制备。用0 8 5 无菌生理盐水校正菌液浓度与0 5 麦氏单位标准比浊管相同(标准比浊管见附录C)，即菌液浓度为l 1 0 8C F U m L 2 1 0 8C F U m L。然后用M-H 肉汤稀释至所需浓度。5 3 3 菌液接种茵液接种后的最终浓度约为5 1 0 5C F U m L。一旦接种菌液在M H 肉汤中被稀释，则1 5r a i n内，接种菌液应加入每个试管中，但作为无菌控制的试管除外。5 4 孵育接种茵液后应尽快放入2 8 恒温箱中孵育，标准孵育时间为2 4h，但对缓慢生长菌株(如爱德华氏菌)孵育时间为4 8h。5 5 读取试验结果抗茵药物敏感性试验结果用最小抑菌浓度(m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n，M I C)表示，即肉眼观察试管中细菌生长完全被抑制时的最小抗菌药物浓度记录为M I C；同时测定质控药物对质控菌株的M I C。6 质量控制6 1 最小抑菌浓度(M I C)的控制限值根据实验菌株的特性，选用荧光假单胞菌(A S l 1 8 0)或副溶血弧菌(A S I 1 6 1 4)为质控菌株，使用盐酸土霉素为质控药物。盐酸土霉素对荧光假单胞菌的M I C 质控范围均为2 0m g L 8 0r a g L；对副溶血弧菌的M I C 质控范围均为1 0m g L 4 0m g L；当质控药物对质控菌株的M I C 超出质控范围时，M I C 结果需舍弃重做。6 2 污染和细菌生长控制无菌控制的培养基试管出现污染或不含抗菌药物的试管细菌未见明显生长时需舍弃全部M I C 结果；任何一列(排)出现跳管现象时，该列(排)M I C 结果应舍弃。7 结果报告试验结果的报告包括受试药物对实验菌株的M I C、质控药物对质控菌株的M I C 和实验菌株的名称、来源、孵育时间。3G B T2 7 6 2 3 1 2 0 1 1附录A(规范性附录)镁离子和钙离子溶液的制备将8 3 6g 的M g C l z 6 H：O 溶解于1 0 0 m L 蒸馏水中(M g”浓度为1 0 m g m L)制成镁离子溶液将3 6 8g 的C a C l。2 H z O 溶解于1 0 0m L 蒸馏水中(C a”浓度为1 0m g m L)制成钙离子溶液0 2 2,t t m 微孔滤膜过滤除菌后于4 保存。附录B(规范性附录)制备抗菌药物母液的溶剂和稀释液表B 1制备抗菌药物母液的溶剂和稀释液G B T2 7 6 2 3 1 2 0 1 1抗菌药物溶剂稀释液阿莫西林、克拉维酸和替卡西林磷酸盐缓冲液，p H 6 0，0 1m o l L磷酸盐缓冲液，p H 6 0，0 1m o l L氨苄西林磷酸盐缓冲液，p H 8 0，0 1m o l L磷酸盐缓冲液。p H 8 0，0 1m o l L阿奇霉素9 5 乙醇蒸馏水氨曲南饱和碳酸氢钠溶液蒸馏水头孢替坦二甲亚砜蒸馏水头孢吡肟磷酸盐缓冲液，p H 6 0，0 1m o l L磷酸盐缓冲液，p H 6 0，0 1m o l L头孢泊肟碳酸氢钠溶液，0 1 0，1 1 9m m o l L蒸馏水头孢他啶碳酸钠溶液，1 0 0 蒸馏水头孢噻吩磷酸盐缓冲液，p H 6 0，0 1m o t L蒸馏水甲砜霉素、氟苯尼考和红霉隶9 5 乙醇蒸馏水土霉素0 0 5m o l L 盐酸蒸馏水克拉霉素甲醇磷酸盐缓冲液，p H 6 0，0 1m o l L西诺沙星、奈啶酸、依诺沙星、氟二分之一体积水，逐滴加入1m o l L蒸馏水罗沙星、氧氟沙星和左氧氟沙星氢氧化钠至溶解亚胺培南磷酸盐缓冲液，p H 7 2，o 1m o l L磷酸盐缓冲液，p H 7 2，o 1m o l L拉氧头孢(双铵盐)0 0 4m o l L 盐酸(放置1 5h 2h)磷酸盐缓冲液，p H 6 0，0 1m o l L利福平甲醇蒸馏水(搅拌)二分之一体积热水和最少量的磺胺类蒸馏水2 5m o l L 氢氧化钠至溶解1 0 终体积的0 0 5m o l L 盐酸或甲氧苄啶蒸馏水(必要时加热)乳酸注：可用蒸馏水作溶剂和稀释剂的药物有阿米卡星、阿洛西林、羧苄西林、头孢克洛、头孢蒙多、头孢美唑、头孢尼西、头孢噻肟、头孢噻啶、头孢噻呋、头孢哌酮、头孢西丁、头孢唑肟、头孢曲松、环丙抄星、恩诺沙星、盐酸沙拉沙星、呋哺西林、克林霉紊、庆大霉素、卡那霉紊、加替沙星、甲氧西林、美洛西林、奈夫西林、奈替米星、苯唑西林、青霉紊、哌拉西林、四环素、妥布霉素、甲氧苄啶(盐酸盐)、大观霉素、万古霉素、盐酸土霉素。G B T2 7 6 2 3 1 2 0 1 1附录C(规范性附录)标准比浊管C 1 用硫酸钡比浊管(O 5 麦氏单位标准比浊管)，标定接种菌液浓度。C 2 比浊管制备方法：取0 0 4 8m o l L 氯化钡(B a C l 2)(质量体积分数为1 1 7 5 的B a C l：2 H。O)0 5m L，加到9 9 5m L 的0 1 8m o l L 硫酸(体积分数为1)溶液中，制成标准比浊管。用光径为1c m的分光光度计测定吸光度来标定比浊管。0 5 麦氏单位标准比浊管在6 2 5n m 波长的吸光度应为0 0 8 0 1 0。选管径与制备菌液试管相同的螺口试管，每管分装4 m L 6 m L。将试管帽拧紧，放室温暗处保存。比浊管用前在旋转振荡器上混匀。如出现较大颗粒，应更换比浊管。每个月更换比浊管或复验比浊管的浊度。