DB51T 716-2007 棉花黄萎病检验鉴定技术规程.doc

DB××/T ××××—×××× 四川省质量技术监督局 发布 2007-12-1实施 2007-11-1发布 棉花黄萎病检验鉴定技术规程 Rule of Detection Method for Verticillium dahliae Kleb. DB/T 716—2007 DB51 四川省地方标准 ICS 67.080.20 B 16 1 DB/T 716—2007 目 次 前 言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 原理 1 5 试剂与材料 1 6 仪器及用具 2 7 取样方法 2 8 典型症状识别 2 9 实验室检验 3 10 结果判定 3 11 样品保存与处理 4 附录A 5 附录B 6 II 前 言 本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站。 本标准主要起草人：宁红、谢成伦、夏季、陈素清、熊玉兰、帅波、颜达。 棉花黄萎病检验鉴定技术规程 Rule of Detection Method for Verticillium dahliae Kleb. 1　 范围 本标准规定了棉花黄萎病（Verticillium dahliae）检验取样方法、田间症状识别、实验室检验、结果判断及样品保存与处理的技术要求。 本标准适用于棉花黄萎病的检验和鉴定。 2　 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB 15569 《农业植物调运检疫规程》 3　 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1　 大丽轮枝菌 Verticillium dahliae Kleb. 一种引起棉花黄萎病的土壤真菌。属半知菌亚门（Deuteromycotina）丝孢纲（Hyphomycetes）丛梗孢目（Moniliales）丛梗孢科（Moniliaceae）。 3.2　 微菌核 microsclerotium 大丽轮枝菌生长过程中，由一条或数条菌丝体进行分隔、膨大、胞壁增厚，并向各个方向芽殖形成的肉眼可见的黑色菌丝颗粒。 3.3　 选择性培养基 selective culture 进行植物病原真菌或细菌分离培养时,为促进目标菌落的形成，抑制其它非目标菌的生长，在培养基中添加不同的碳源、氮源或抑制性物质而形成的具有一定选择能力的培养基。 4　 原理 棉花黄萎病是一种土传病害，其病原菌大丽轮枝菌主要在土壤、病残组织、粪肥等处越冬，病原菌同时可以潜伏于种子内部和附着于种子表面，以菌丝或微菌核形式在种子内外越冬。棉花植株所表现的病害典型症状特征是进行棉花黄萎病田间诊断的初步依据；采用选择性培养基，从不同的带菌材料中分离出大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.，根据病原菌形态特征最终进行棉花黄萎病鉴定。 5　 试剂与材料 除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 5.1　 磷酸氢二钾 K2HPO4 5.2　 氯化钾 KCl 5.3　 硫酸镁 MgSO4 5.4　 乙二胺四乙酸铁钠 [CH2N(CH2COO)2]2FeNa 5.5　 L-天门冬酰胺 C4H8N2O3H2O 5.6　 L-山梨糖 C6H12O6 5.7　 琼脂 Agar 5.8　 75%五氯硝基苯 C6Cl5NO2 5.9　 牛胆盐 cow tile salt 5.10　 四硼酸钠 Na2B4O7 ·10H2O 5.11　 硫酸链霉素 C21H41N7O16S 5.12　 葡萄糖 C6H12O6.H2O 5.12 马铃薯 potato 6　 仪器及用具 天平、高压灭菌锅、培养箱、生物显微镜、微量移液器、移液器、解剖刀、接种棒、培养皿、烧杯、载玻片、盖玻片、吸管等。 7　 取样方法 7.1　 种子取样 需要进行室内棉花黄萎病检验的棉籽，按GB 15569 《农业植物调运检疫规程》6.1 的要求进行取样，填写完整的取样标签，送实验室检验鉴定。 7.2　 受害植株取样 在棉花生长期间，特别是现蕾后棉花黄萎病发病高峰期，加强田间观察，发现有棉花黄萎病典型症状或疑似症状的植株，整株取样送实验室检验鉴定。 7.3　 土壤取样 7.3.1　 定点取样 对具有棉花黄萎病典型症状或疑似症状的植株，直接取植株根部周围0.3 m2范围内、5 cm深的表土，四分法制样后，取土样约500 g送实验室检验。 7.3.2　 随机取样 对棉花黄萎病发生田块进行整田病原调查时，对角线5点取样，每点在2 m2 范围内取5 cm深的表土约1 000 g，将各点土样混和后，四分法制样，取土样约500 g送实验室检验。 8　 典型症状识别 8.1　 幼苗期症状 一般在3至5片真叶期显示症状，病株比正常植株略矮，叶片上出现斑驳。 8.2　 成株期症状 棉花黄萎病大多在现蕾后开始发病，7-8月开花结蕾期达到发病高峰。病株从下部开始发病，逐渐向上发展，病叶边缘和叶脉之间叶肉部分出现淡黄色斑驳，形状不规则，逐渐扩大成明显的黄色斑驳，随后斑驳变褐。发病严重时，除主脉及主脉附近仍为绿色外，其余部分均变为黄褐色，病叶呈掌状斑驳，俗称“西瓜皮”；有时病斑变褐、焦枯、脱落，只残留叶脉，呈“鸡爪状”。夏季暴雨或大水漫灌后，植株可出现急性萎蔫症状，叶片突然萎蔫下垂，叶色暗淡。用解剖刀横切或纵切病株茎杆和叶柄，可见维管束变褐。 9　 实验室检验 9.1　 种子检验 9.1.1　 制样 将送检的每个棉籽样品分为2份，一份保存备查，一份用于检验，每份样品不少于50 g。 9.1.2　 病原菌分离培养 将待检棉籽置于Christen选择性培养基平板上，每个平板放置5～10粒，每个样品设3个重复。平板置于21 ℃～23 ℃黑暗培养10 d。Christen选择性培养基配方及制作方法见附录A。 9.1.3　 菌落筛选和转接 检查培养10 d后的平板，若出现直径约0.1 mm的乳白色菌落，将其转接至PDA培养基上，并在21 ℃～23 ℃黑暗培养10 d～15 d以上。PDA培养基配方及制作方法见附录A。 9.1.4　 病原鉴定 观察微菌核的形成情况，并挑取PDA平板上的培养物进行显微镜检查，根据附录B描述的病原菌形态特征进行鉴定。 9.2　 植物组织检验 9.2.1　 制样 选取有典型症状的植株材料，叶片材料取病健交界处组织每个约0.5 cm2；茎杆、叶柄材料直接切取维管束变色部分组织每个长约0.5 cm。 9.2.2　 病原菌分离培养 将取得的植物组织置于Christen选择性培养基平板上，每个平板放置5～10个，每个样品设3个重复。平板置于21 ℃～23 ℃黑暗培养10 d。 9.2.3　 菌落筛选和转接 同9.1.3。 9.2.4　 病原鉴定 同9.1.4。 9.3　 土壤检验 9.3.1　 制样 取待检土壤每个样100 g放入500 ml烧杯中，加入100ml蒸馏水，充分搅拌1 min，静止30 s。取上层悬浮液备用。 9.3.2　 病原菌分离培养 取200 µl土壤悬浮液滴加于Christen选择性培养基平板上，用接种棒涂抹均匀，每个样品设3个重复。平板置于21 ℃～23 ℃黑暗培养10 d。 9.3.3　 菌落筛选和转接 同9.1.3。 9.3.4　 病原鉴定 同9.1.4。 10　 结果判定 转接至PDA平板上的培养物培养10 d～15 d后，平板上有微菌核产生；且显微镜下观察其形态特征，符合附录B描述的大丽轮枝菌形态特征，培养物为引起棉花黄萎病的病原菌Verticillium dahliae Kleb.。 11　 样品保存与处理 完成检验后，样品和分离物需作为标本保存的，制成标本并妥善保存。其余用于检测的样品应集中销毁，用具应进行灭活处理。 附　录　A （规范性附录） 培养基配方及制作方法 A.1 Christen选择性培养基配方及制作方法 A.1.1配方 磷酸氢二钾1 g，氯化钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，乙二胺四乙酸铁钠0.01 g，L-天门冬酰胺2 g，L-山梨糖2 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 ml，75%五氯硝基苯1 g，牛胆盐0.5 g，四硼酸钠1 g，硫酸链霉素0.3 g。 A.1.2制作方法 琼脂20 g加入蒸馏水1000 ml，加热溶化后，加入磷酸氢二钾1 g，氯化钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，乙二胺四乙酸铁钠0.01 g，L-天门冬酰胺2 g，L-山梨糖2 g，充分混和溶解。用磷酸将pH值调至5.4，分装，120 ℃～125 ℃高压灭菌30min，温度降至50℃（不烫手）时加入75%五氯硝基苯1 g、牛胆盐0.5 g，四硼酸钠1 g，硫酸链霉素0.3 g，混和均匀。 A.2 PDA培养基配方及制作方法 A.2.1配方 马铃薯200 g，葡萄糖（或蔗糖）10 g～20 g，琼胶17 g～20 g，水1000 ml。 A.2.2 制作方法 将洗净去皮的马铃薯切碎，加水1000 ml煮沸1 h，用纱布滤去马铃薯，加水补足1000 ml；加入糖和琼胶，加热使琼胶完全熔化后，分装，120 ℃～125 ℃高压灭菌30min。 附　录　B （资料性附录） 大丽轮枝菌在PDA培养基上的形态特征 B.1大丽轮枝菌形态特征 菌落呈绒毛状，初生菌丝体无色，生长时间较长的菌丝变成灰白色，有隔膜。培养10d以上的菌落可在培养基上长出大量黑褐色微菌核，长形至不规则球形，直径15~50 µm。分生孢子梗由2~4轮层辐射状的枝梗及上部的顶枝构成，每轮层有枝梗1~7枝，分枝大小为13.7~21.4×1.5~2.7 µm，基部略膨大，始终透明。小枝顶端的产孢瓶体连续产生分生孢子，分生孢子无色，单孢，椭圆形、近圆筒形，大小为1.9~3.57×2.5~7.38µm。 B.2 大丽轮枝菌与黑白轮枝菌形态特征比较 大丽轮枝菌与黑白轮枝菌Verticillium albo-atrum为同属土传病原真菌，在鉴定过程中不易区分，两种病原菌形态特征主要区别见表B。 表B 大丽轮枝菌与黑白轮枝菌形态特征比较 病原菌 菌落形态 分生孢子梗 休眠结构 30 ℃生长状况 大丽轮枝菌 绒毛状，圆形，白色 较短，无色 微菌核 生长良好 黑白轮枝菌 绒毛状，圆形，白色至黑褐色 较粗壮，基部暗色膨大 黑褐色厚壁休眠菌丝 生长不良 6