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G B/T 1 8 6 5 3-2 0 0 2前言 本标准是依据加拿大国家动物疾病研究所的实验室操作规程，结合本国实际情况制定的，通过大量试验，证实该方法准确可靠。本标准的附录A是标准的附录，附录B是提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:天津动植物检疫局。本标准主要起草人:秦贞奎、侯艳梅、张碧波。中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准胎J L 弯曲杆菌的分离鉴定方法G B/T 1 8 6 5 3-2 0 0 2Me t h o d s f o r i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f c a mp y l o b a c t o r f e t u s1 范围本标准规定了胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法本标准适用于牛、绵羊、冷冻精液胎儿弯曲杆菌的检验，其他动物可参照使用2 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定2.1 设备和材料2.1 门 混合气体 质量比为3.5%氧(0 0,1 0%二氧化碳(C 0 2),8 6.5%氮(N,)口。2.1.2 厌氧培养罐。2.1.3 采样棒及吸球2.1.4 2 mL注射器，5 号针头，2 0 号针头。2.1.5 灭菌青霉素瓶及生理盐水。2.1.6 供常规细菌分离鉴定用的基本设备与材料。2.2 培养基和试剂 见附录A(标准的附录)。2.2,1 增菌运输培养基(T E M)o2.2.2 半胧氨酸牛心浸膏培养基(C H),2.2.3 琼脂培养基(MH),2.2-4 疏基乙酸盐肉汤。2.2.5 相关生化试剂。2.3 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定程序见附录B(提示的附录)示意图。2.4 分离培养2.4.1 样品采集2.4-1-，母牛站立或六柱栏保定，用 5%来苏儿消毒牛的外阴部，将采样棒的采样端插人阴道，压扁另一端的吸球，并来回抽动，吸取阴道粘液。取出采样棒后，插人盛有3 m I灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数次，再将采样棒放人消毒液中。2.4.1.2 公牛六柱栏保定，用绳子固定采样侧的后肢，剪短阴筒外部的阴毛，用 5%的来苏儿消毒公牛的尿道口，将采样棒的采样端插人阴筒内，将另一端的吸球压扁并来回抽动，吸取包皮液。取出采样棒迅速插人盛有 3 m l灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数次。2.4.1.3 样品液静置 1 m i n-2 mi n，用灭菌注射器吸取上清液 2 m L，分别注人两瓶增菌运输培养基(见附录A中A 1)中，每瓶 1 m L。振荡混匀，尽快送至实验室。2.4-1.4 取样品做革兰氏染色并做湿涂片镜检。也可用棉拭子荫取样品液直接涂布于含抗菌素的MH(见附录A中A 3)或C H(见附录A中A 2)琼脂平板上。2.4.2 已接种样品的增菌运输培养基置3 7 C 培养 7 2 h。用直径3 m m的接种环将增菌液分别划线于两个MH或C H平板培养基上，将平板放置厌氧培养罐中，将雄内空气抽出，达到一5.5 k P a 时停止，充中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局 2 0 0 2 一 0 2 一 1 9 批准2 0 0 2-0 5 一 0 1 实施G s/T 1 8 6 5 3-2 0 0 2人经0.2 2 p m滤膜过滤的混合气体至负压为零，再将气体抽出和充人反复两次。将培养罐在3 7 C 培养7 2 h。以后胎儿弯曲杆菌均需在混合气体条件下培养。2.4.3 观察MH,C H培养基上有无疑为胎儿弯曲杆菌的菌落，如无可弃之如有，将典型或可疑菌落划线于MH或C H琼脂平板培养基上培养 7 2 h e 胎儿弯曲杆菌在MH或C H平板培养基上的菌落特征为:不溶血、半透明、光滑、周边整齐、圆整、直径为1 mm左右。2.5 鉴定2.5，筛选试验2.5.1.，取典型或可疑纯培养物做革兰氏染色、湿涂片动力观察、氧化酶试验及过氧化氢酶试验(试剂配方见附录A中A 5,A6)o 胎儿弯曲杆菌为革兰氏染色阴性，呈螺旋状或“S,，状，一些老龄培养物可出现球状或球杆状，不形成芽胞和荚膜，在菌体的一端或两端有鞭毛，呈特征快速螺旋状穿梭运动。氧化酶试验为阳性:5.1.25.2 纯培养平板用后尽快放回混合气体环境中，以备进一步做生化试验用。生化试验2.5-2.1 将符合 2.5.1.1 条的培养物按表1 进行生化试验。表 1 胎儿弯曲杆菌生化反应菌名过氧化氢酶试验硫化氢(H,S)试验生长试验药敏试验马尿酸钠水解 试验氧化酶 试 验2 5 C4 2C1%甘氨酸1%胆 汁 3.5%抓化钠(N.C l)蔡陡酮酸 3 0 0 g/片头抱称素3 0 p g/片胎儿弯曲杆菌胎儿亚种于+RS十胎儿弯曲杆菌性病亚种+RS2.5-2.2 所有生化试验管均于混合气体环境中培养3 d。带胶盖或螺旋盖的试管，培养时应将试管盖放松。2.5.2.3 生长试验:纯培养后的菌接种到2 管疏基乙酸肉汤(见附录A中A 4)中，分别放 4 3 和2 5 C温箱培养7 2 h观察结果，肉汤上层出现雾状混浊时，说明细菌已生长。2.5.2.4 硫化氢(H,S)试验:纯培养后的可疑菌种接种于琉基乙酸肉汤中，试管口悬吊一条长X宽为2 0 m m X 6 m m的乙酸铅滤纸，观察3 d-4 d，如见滤纸变黑即为产生H 多之证。2.5.2.5 甘氨酸、抓化钠、胆汁生长试验:可疑菌种分别接种于含1%甘氨酸、3.5 0 o 抓化钠、1%胆汁生长的琉基乙酸肉汤中，3 7 C培养 7 2 h,培养基近表面有云雾状生长为阳性。2.5.2.6 药物敏感试验:用铂金耳挑取可疑菌落放于1 m L灭菌生理盐水试管中，菌液浓度约为 3 X1 0“个/m l，用灭菌 1 棉拭子馥取细菌稀释液涂于MH琼脂平板上，然后用镊子把含有 3 0 t g 蔡吮酮酸和头抱霉素的滤纸片贴在MH血平板上，在混合气体中3 7-C 培养2 4 h-7 2 h，量溶菌区，0-1 8敏感,0 镇1 4 m m为不敏感。mm 为2 2 9G B/T 1 8 6 5 3-2 0 0 22.5-2.7 马尿酸钠水解试验:取 4 8 h-7 2 h培养物接种于。4 mL l%马尿酸钠液(见附录A中A7.1)中制成浓厚菌悬液 3 5 C-3 7 C水浴 2h，再加人。.2 mI苟三酮试剂(见附录A中A7.2),混匀后水浴2 0 m i n观察结果，变深紫色为阳性，淡紫色或不变色为阴性。可用 1 8 h-2 4 h变形杆菌培养物作阳性对照2.5.3 结果判定 根据 2.5.1 和2.5.2 的结果进行。2.5.11 凡符合胎儿弯曲杆菌一般特征和生化特性的菌，均判定为胎儿弯曲杆菌。2.5-3.2 过氧化氢酶试验,H 2 S试验,1%胆汁生长试验,3.5 Y.抓化钠生长试验和马尿酸水解试验，其中任何一项不符合胎儿弯曲杆菌特性，均判定为非胎儿弯曲杆菌。2.6 报告结果的表示2.6.1 阳性结果:“发现胎儿弯曲杆菌”、“发现胎儿弯曲杆菌胎儿亚种”或“发现胎儿弯曲杆菌性病亚种”2.6.2 阴性结果:“未发现胎儿弯曲杆菌”。G B/T 1 8 6 5 3-2 0 0 2 附录A(标准的附录)培养基和试荆A 1 增菌运输培养墓(t r a n s p o r t e n r i c h m e n t m e d i u m,T E M)成牛血清1 0 0 0 MI 5-氟尿啥咤。3 g 放线菌酮。，1 9 蔡吮酮酸3 m g 多粘菌素B 1 0 0 0 0 0 I U 1 0 0 煌绿5 m l,将各种成分无菌操作加人到成牛血清中，充分混合后分装于2 0 m l 一 带胶皮塞(能密闭)的玻璃瓶中，每瓶8 M I，然后水浴或在蒸气中加热 2 m i n-3 m i n(无压力)，使血清凝固，冷却后用灭菌玻璃棒将血清凝块捣碎。最后无菌操作充人混合气体 3.5%氧气(O z),1 0%二氧化碳(C 0 2),8 6.5%氮气(N,)o将制备好的T E M 培养基保存在 4 C冰箱中，可使用 4 个月。A 2 C H培养基(c y s t e i n e h e a r t b l o o d a g a r)(含抗菌索)牛心浸液(或牛心粉3 0 g)5 0 0 g 胰蛋白 陈1 0 g 右旋糖1 0 g 抓化钠5 9 L 一 半胧氨酸1 9 琼脂1 2 9 蒸馏水1 0 0 0 ml_ p H6.9-7.0 加热溶解各成分后 1 0 7.9 k P a 高压 1 5 m i n，培养基冷却至5 0 C-5 5 时，无菌加人:多粘菌素B 2 m g 新生霉素2 m g 放线菌酮2 0 m g 绵羊血1 0 0 mL 混匀，倾注平板。放 4 C水箱备用。A 3 MH培养基(m u e l l e r h i n t o n a g a r)(含抗菌寮)牛肉浸膏酪蛋白水解物淀粉琼脂蒸馏水p H7.4 士0.2各成分加热溶解，1 0 7.9 k P a 高压1 5杆菌肤5g1 7.5 g1.5 g1 5 g1 0 0 0 ml,m i n，冷却至5 0 C -5 5 C 时，无菌加人:2 5 0 0 0 I UG B/T 1 8 6 5 3-2 0 0 2放线菌酮多粘菌素 B新生霉素绵羊血混匀，倾注平板。4 C冰箱保存。5 0 mg1万 l u5 mg5 0 m一 1 0 0 mLA 4 疏基乙酸盐肉汤 1,胧氨酸。.5 m g 氯化钠2.s m g 右旋糖5.5 g 酵母浸膏5 。g 酪蛋自 胰消化物(P a n c r e a t i c D i g e s t o f C a s e i n)1 5.0 g 琉基乙酸钠。5 9 蒸馏水1 0 0 0 m l 加热至溶解，调整p H 7.2 士0.2,5 m L试管分装，1 0 7.9 k P a 高压灭菌1 5 m i n,新制备的培养基(Al-A 4)均应做无菌检查，并用已知阳性菌和阴性菌进行测试，以保证培养基的质量。A 5 氧化酶试剂 1 写盐酸二甲苯对苯二胺水溶液，置棕色瓶中现用现配，-l o 保存，有效期一周。用于氧化酶试验A 6 3%过妞化氮(H 2 0 2)3 0 写H2 02 1 0 ml-蒸馏水9 0 m l,装于棕色瓶中，有效期为一周。用于触酶试验。A 了 马尿酸盐水解试验A 7.1 1%马尿酸钠 马尿酸钠1 g 蒸馏水1 0 0 m lA 7.2 水合荀三酮 苟三酮3.5 g 丙酮5 0 mL 丁酮5 0 ml,G B/r 1 8 6 5 3-2 0 0 2 附录B (提示的附录)胎儿弯曲杆菌分离鉴定程序示意图2s a