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GB 1 T 1 8 6 4 1-2 0 0 2前言 伪狂犬病(p s e u d o r a b i e s,Y R;A u j e s z k y s d i s e a s e,A D)是危害猪、牛、羊、狗、猫、家兔等多种家畜和野生动物的一种急性传染病。除猪以外的动物感染伪狂犬病病毒后，主要是以发热、奇痒和脑脊髓炎症状为特征.以死亡为结局，并呈散发形式。本病对养猪业危害最大，猪感染后可引起妊娠母猪流产、产死胎和木乃伊胎;仔猪大量死亡，1 5日龄内死亡率为 1 0 0%,断奶仔猪死亡率 1 0%-2 0%，种猪不育，母猪返情，空怀，公猪翠丸发炎肿胀、萎缩、失去种用能力;育肥猪增重缓慢、饲料报酬降低。本病呈世界性分布。本标准规定的病原学诊断方法主要用于死亡动物的病料检测和活体动物的鼻拭子样品检测，其中聚合酶链反应具有快速、灵敏的特点，可用于大批样品的检测。血清学诊断主要用于非免疫动物的诊断、血清流行病学调查和免疫动物的抗体水平监测。中和试验特异性强，是国际通用的法定方法，可用于日岸进出口检疫;胶乳凝集试验，简便快速、敏感性高、特异性强，适用于基层现场检测;酶联免疫吸附试验适用于实验室大批样品检查、产地检疫、流行病学调查和无本病健康猪群的建立。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D都是标准的附录，附录E是提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准由华中农业大学畜牧兽医学院负责起草，农业部动物检疫所参加起草 本标准主要起草人:陈焕春、何启盖、李晓成、吴斌、方六荣、金梅林、邱德新、吴美州。中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 8 6 4 1-2 0 0 2伪 狂 犬 病 诊 断 技 术D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r A u j e s z k s d i s e a s e1 范围 本标准规定了伪狂犬病的诊断方法 本标准适用于猪、羊、犬、猫等及其他易感动物伪狂犬病的诊断。其中病毒分离鉴定、聚合酶链式反应、家兔接种试验适用于伪狂犬病病毒的检测;中和试验、酶联免疫吸附试验适用于非免疫动物伪狂犬病抗体的检测以及免疫后抗体水平的监测;胶乳凝集试验适用于实验室和现场对伪狂犬病抗体的早期检测。2 病毒分离鉴定2 门试验材料 改良最低要素营养液(D ME M)培养基配方见附录A(标准的附录)，仓鼠肾细胞(B H K 2,)或猪肾细胞系(P K-1 5)细胞，新生犊牛血清，青霉素，链霉素，。.2 2 p m微孔滤膜，细胞培养瓶。2.2 操作步骤2.2 门病料的采集 对死亡病畜或活体送检并处死的动物，以无菌手术采集大脑、三叉神经节、扁桃体、肺等组织，冷藏送实验室检测2.2.2 样品处理:待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或 D ME M 培养液(见附录A 制成I，5 乳剂，反复冻融三次，经3 0 0 0 r/m i n 离心3 0 m i n 后，取上清液经0.2 2 p m微孔滤膜过滤，加人青 霉素溶液至最终浓度为3 0 0 l U/m 工 一、链霉素为1 0 0 p g/m l，一7 0 保存作为接种材料2.2.3 病料接种:将病料滤液接种已长成单层的B H K 细胞(或P K-1 5 细胞)，接种量为培养液量的1 0 Y,3 7 C 恒温箱中吸附1 h，加人含 1 0%新生犊牛血清(已经过5 6(水浴灭活3 0 m i n，过滤除菌，无支原体)的D ME M培养液，置 3 7 C温箱中培养。2.2.4 观察结果:接种后3 6 4-7 2 h，细胞应出现典型的细胞病变效应(C P E)，表现为细胞变圆，拉网、脱落。如第一次接种不出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无细胞病变，则判为伪狂犬病病毒检测阴性2.2.5 病毒的鉴定:将出现细胞病变的细胞培养物，用聚合酶链反应或家兔接种试验，或作进一步鉴定。3 聚合酶链反应3.1 试验材料 蛋白酶K,f 一 二烷基硫酸钠(S D S)，苯酚，三氯甲烷，异戊醇(分析纯)，澳化乙锭(E B),T E N缓冲液 见附录B(标准的附录)。引物:扩增伪狂犬病毒基因中4 3 4-6 5 1 碱基对(b p)之问2 1 7 b y基因片段，序列为 V-游引物 I I I中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2 0 0 2-0 2-1 9 批准2 0 0 2-0 5-0 1 实施G B/T 1 8 6 4 1-2 0 0 25 -(A G G A G G A C G A(;C T G G G G C T-3 ，下游引物 P 2:5 -G T C C A C G C C C C G C T T G A A G C T-3 o3.2 操作步骤32.飞 样品的采集:对于病死或扑杀动物，取大脑和三叉神经节、扁桃体、肺等组织;对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸人猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件下送实验室检测。3.2.2 样品处理每份样品分别处理。采病料经组织研磨器充分研磨，按 I:5 用T E N缓冲液(见附录 B中1 3 1)悬浮收集于离心管内，反复冻融 3次，7 0 0 0 r/mi n离心 5 m i n，如样品为鼻拭子，则加入2 n il,T E N 缓冲液 充分挤压，取出棉拭子，7 0 0 0 r/m i n 离心5 m i n，取上清液4 7 2.5 川，加人2 5 可 I o%1 一 二烷基硫酸钠(见附录“中B 4)和2.5 p I的2 0 m g/m I蛋自酶K(见附录B中B 3),5 0 C 水浴摇床上放置2 h 后加人等量的饱和酚溶液5 0 0 川，涡旋2 0 s 离心取上清液，加等量的酚三氯甲烷，异戍醇(2 5:2 4:1)抽提一次，再用等量的三氯甲烷:异戍醇(2 4:1)抽提一次，最后用两倍的无水乙醇沉淀，真空抽干后加人2 0 1,1双蒸水溶解(此即为“模板”)，一2 0 C 贮存备用。12.3 聚合酶链反应(P C K)的操作程序:先将制备的模板D N A置 1 0 0 C 水浴 1 0 mm作变性处JT，然后立即放于冰浴中 P C R反应体系(按摩尔浓度计算)为:总体积 2 5 川，含有 5 0 m m o l/l.(氯化钾)(K C I),1 0 mmo l/I，三经甲基氨基甲烷一 盐酸(C h r i s-H C D(p H 9.0),0.1%-.I甲基氨基甲烷溶液(0.7%T r i t o n X-1 0 0),1 0 0 p m o l/L d N T P s,0.3 5 p m o l/I引物，2 m o l/I氯化镁(Mg c l )，及0.5 U台克(T a y)D N A聚合酶,2 0 I 模板D N A 最后加人矿物油约2 0 川 覆盖 扩增条件为:9 4 C 变性 3 m i n，进人循环，9 4 C 6 0 s,6 5 C6 0 s,7 2(6 0 s,4 0 个循环后 7 2 C 延伸5 m i n12.4 P C R产物的检测:将样品分别加于1%琼脂凝胶板的各样品孔中，有一孔加标准阳性样品，每孔1 0 川一1 5 川 _ P C R扩增产物，进行电 泳，澳化乙 锭(见附录B中B 2)染色，在紫外光下观察结果。电泳区带迁移率与标准阳性样品区带迁移率相同的待检样品应判为阳性 为进一步进行P C R扩增产物的特异性鉴定，可取P C R产物用S a l I 酶切，酶切产物在2 0 o 琼脂糖凝胶上电泳，澳化乙锭染色，在紫外光下观察并与 标准分子量相对照，阳 性样品可出现1 4 0 b y 和7 7 b y 两个片段4 家兔接种试验4.1 家兔的选择 选择健康成年家兔，用血清中和试验、胶乳凝集试验、琼脂扩散试验或酶联免疫吸附试验检测，证实为伪狂犬病抗体阴性。4.2 病料的采集及处理 无菌采集疑为该病死亡或扑杀动物的脑组织、扁桃体、淋巴结，混合后剪碎，用组织匀浆器研磨，用火菌生理盐水配成1，5 乳悬液，反复冻融2-3 次后，以3 0 0 0 r/m i n 离心1 0 m i n，取上清液加人青霉素和 链霉素溶液，最终浓度分别为1 0 0 I U/m L和1 0 0 l e g/m L,置4 C 冰箱中作用1 2 h，作为待检样品。4.3 病料接种 将待检样品经颈部皮下注射接种，每只家兔接种1 m 工 一 2 m L,4.4 结果观察和判定4.4.1 伪狂犬病毒感染阳性:被接种动物在接种后 2 4 h-4 8 h注射部位出现奇痒，家兔啃咬注射局 部，导致皮肤溃烂，家兔尖叫、口吐白沫，最终死亡4.4.2 伪狂犬病毒感染阴性:接种家兔仍健活，判为阴性。5 血清中和试验 5 门试验材料 0.2 5/0 胰酶(胰蛋白酶2 5 0 m g 加人1 0 0 m l汉克氏(H a n k s)液中，充分溶解后，过滤除菌，2 0 保 存),P K-1 5 细胞;伪狂犬病阳性血清、阴性血清、伪狂犬病标准弱毒株;9 6 孔细胞培养板G B/T 1 8 6 4 1-2 0 0 25.2 操作步骤5.2.1 病毒半数组织培养感染量(T C I D,)的测定5.2.1 门病毒培养和收获:将伪狂犬病毒标准毒株接种于长成单层的P K 1 5 细胞 接种量为培养液的十分之一，3 7 C 培养，待出现病变后，冻融，收获病毒52.1.2 病毒的滴定 用D ME M培养液将伪狂犬病病毒作连续 1 0 倍稀释，即 1 0-,1 0-e.每个稀释度取()。川 加人 9 6 孔细胞培养板中，随后加人经。2 5 胰蛋白酶消化的P K-1 5 细胞悬液 1 0 0 爪(细胞含量以1 0,个/m l左右为宜).每个稀释度作 8 个重复，并设正常细胞培养对照。置 3 7 C 5%二氧化碳培养箱中。5.2.1.3 T C I),计算:逐 日观察细胞病变和对照，共观察 3d-4d天，并记录细胞病变孔数。按照R c e dMu e n c h 法计算病毒的T C I D,见附录E(提示的附录)。5.2.2 中和试验5.2.2.1 血清的处理:将无菌采集的待检血清置5 6 C 水浴灭活3 0 m i n,5.2.2.2 血清的稀释;在细胞培养板各孔中加入5 0 p L D ME M培养液，随后在第 I 孔中加人待检血清5 0 川 混合后，用微量移液器取出5 0 u L，加到第2 孔中，混匀后取出5 0 川、再加人第3 孔中，依此类推，直至第1 0 孔(将混合液弃去5 0 川 一)，血清稀释度即为1，2,1，4,1，8.I，1 0 2 4，每份待检血清稀释度作 3个重复5.2.2.3 加人病毒:将 5 0 I含2 0 0 个T C I D,。的病毒液加到不同稀释度的血清孔中，3 7 C 作用 1 h,5.2.2.4 每血消孔中加人 1 0 0 I,经胰蛋白酶消化分散的P K-1 5 细胞悬液(细胞含量以1 0 5 个/mI左右为宜)。52.2.5 设li:对照组5.2.2.5.1 病毒回归试验:每次试验每一块板上都设立病毒对照，先将 2 0 0 T C I D.o/5 0 ml 一 病毒液作1,1 0,1 0 0.1。倍稀释，每个 稀释度作4 孔，每孔加1 0 0 t d,病毒液，然后每孔1 0 0 川 P K-1 5 细胞悬液。5.2.2.5.2 阳性血清、阴性血清、待检血清和正常细胞对照5,2.2.6 结果观察:逐C 1 观察，记录病变和非病变孔数，共观察7 天。病毒回归试验中。，1 T C I D,o 应不引起细胞病变，而1 0 0 T C I D。应引起细胞病变，阳性血清、阴性血清、待检血清和正常细胞对照成立，测定结果方有效，否则该试验不能成立。5.2.3 计算抗体中和效价 观察后确定能对细胞培养5 0 环保护的血清最大稀释度，计算抗体中和效价。如抗体效价为1:2 及 1:2 以匕则判为伪狂犬病抗体阳性。6 酶联免疫吸附试验 6.1 试验材料 抗原、酶标抗体、阴性血清、阳性血清;底物邻苯二胺一 过氧化氢(O P D-H 2 0 2)溶液，抗原包被液