bz001000282.pdf

(;B/,r 1 8 6 3 6 2 0 0 2前卜J 本标准根据我国近二 十 年对蓝舌病诊断的研究成果和技术的发展，参考世界动物 P.几 组织厂 w。山!O r g a n i z a t i o n f o r A n i m a l il e a I t h(#),O f f i c e I n t e n t i o n a l d e s E p i z o o t i c(法).()工 G 标准性文 件 世界 动物I 1.生组织推荐的诊断力 一 法和生物制品标准手 册)2.1.9 条“蓝占 病”和澳大利亚动物疫病标雕诊断方法 B l u e t o n g u e帝而编写的 本标准引用了G I3/T 1 8 0 8 9-2 0 0(A 微量中和试验及病毒分离和鉴定方法有关规定力法 俄舌病是由库蝶传播、蓝舌病病毒引起的仗害反当动物的严重传染病。蓝舌病病毒系呼肠孤病毒科环状病毒属 t 3 群成员、国际已知有2 4 个血清型，在血清学 卜 与环状病毒属相关病毒有交叉反应:该病毒主要引起绵羊发病和死亡 牛及其他反=1 动物常为隐性感染，但川通过媒介昆虫传播本病鉴于该病的诊断和检疫技术复杂，因此应建立该病的综合诊断技术标准.这是制定本标准的宗旨 本标准规定的方法，分别适用于病A t 分离鉴定、病原检测、病毒血清j 1 鉴定和抗体检测等不同需要。木标准的附录A、附录日都是标准的附录，附录C是提示的附录。本标准山中华人民共和国农业部提出。本标滩山个国动物检疫标准化技术委员会归C I,本标准起草单位:云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室、农业部动物检疫所、大津动植物检疫)1.)本标准主要起草人:张念祖、杨承谕、李志华、张富强、胡玉玲、张开礼、马洪超、赵祥平、向文彬中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准蓝舌病诊断技术 Di a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r b l u e t o n g u eG B/,r 1 8 6 3 6-2 0 0 21 范 围本标准规定 J 蓝舌病的诊断技术和程序。本标雕适用于蓝舌病的诊断和检疫。4,5,6 章用于病毒分离鉴定和病原检测,7,8 章用于病毒的血清型鉴定，9,1 0 章用于抗体检测。2 引用标准下 列标准所包括的条文.通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订.使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。(B/f1 8 0 8 9 2 0 0 0 蓝舌 病微W血清中和试验及病毒分离和鉴定方法3 病毒分离和鉴定3.1 器械和设备3.1.1%孔组织培养板(平底，简称 9 6 孔板)，单道微量加样器(0.5 1 1 一1 0 1 L,5 1,1,-1 0,1 1 4 0 1 1 一，0 p 1.2 0 0 ta l 一1 0 0 0 1 1)及 滴头，八道连续加样器(5 0 f l,1 0 0 V 1 _,1 5 0 u L,2 0 0 1 1)及滴头3 门.2 1(、2 o C、一 8 0(冰箱，普通恒温培养箱及二氧化碳培养箱。3 门.3 鸡胚开孔器，照蛋箱或鸡胚用灯，组织捣碎器及擦镜纸(高压灭菌备用)。3.1.4 超声波粉碎器，低速离心机，倒置显微镜及荧光显微镜I2 试剂 卜 J 材料12 门肝素抗凝血采血竹3.2.2 细胞:蚊子细胞(C 6/3 6)、仓鼠肾细胞(B H K,)或非洲绿猴肾细胞(V e r o)3.2.3 细胞培养液及分散液(按常规配力配制)3.2.4&ir,病p-s隆抗体(1 8 n 3 B 6,7 D 3 n2)o12.5 蓝r-病荧光抗体12.6 1()一1 1 l1 龄鸡胚。13 病毒分离I11 样品的采集和制备见(:B/1 1 8 0 8 9-2 0 0 0中8.1。I12 鸡胚接种见(.B 门 1 8 0 8 9-2 0 0 0 中8.2I13 接种细胞33.3.1 将捣碎的鸡胚肝组织离心，2 0 0 0 r/m i n,1 0 m i n，取r.清液 为避免不必要的“有传”先对待分离材料进行捕获酶联免疫吸附(E L I S A)试验(见第 章)，将呈阳性的反应材料接种(;6/3 6 细胞，睡份样.结接两管(瓶)，梅管(瓶)接。.2 ml。将接种细胞置于 3 0 C 温箱培养 7 d13.3.2 吹打接种的(6/3 6 细胞，接种于B H K 细胞，侮份C 6/3 6 接种八管(瓶)B H K，旬管0.2 m l，接 种 的 B I I K细 胞 t i:于3 7(环 境 中，吸 附t h 一 h R A I 生)竺 兰全1 夔 鲤选竺2 缨燮些 堕生中华人民共和国国家质里监督检验检疫总局2 0 0 2-0 2-1 9 批准2 0 0 2-0 5出现细0 1实施G B/7 门8 6 3 6-2 0 0 2胞病变 C I E)者收获，无细胞病变(C P E)者在B H K 细胞育传 几 代，仍无细胞病变弃之13.4 病毒保存及 1 _ 作液的制备13.4 门B H K F.出现细胞病变的病毒悬液J B 1 m l 无菌小管分装，作为原始毒，置3.3-4.2 川原始毒于B H K.细胞上扩增，分装保存，记为“原始毒+1”33.4.3“原始毒+1 1，按 3.3.3.2 方法增殖，分装、保存，作为贮存毒液3.3.4.4 贮存毒液增殖分装，4 C 保存，作为工作毒液，用于病毒鉴定3.4 病毒鉴定 鉴定方法见G B 月 1 8 0 8 9-2 0 0 0中9.1 及本标准 4.68 0 C 保存。d 免疫酶染色(i m m u n o e n z y m e s t a i n)4 门器械和设备4.1.1 9 6 孔组织培养板(平底)，单道加样器(0.5 V I 一1 0;A l.,5;,l一 1 0 川 J、魂 p l-2 0 0 u 1.,2 0 0;,L-1 0 0 0 I d,)及滴头，八道加样器(5 0 1,11 0 0 i l-1 5 0 p L.2 0 0 曰及 滴头 稀释试 I 用小瓶4.1.2 普通恒温箱(3 7 C),4、一2 0 冰箱及倒置显微镜4.2 试#M与材料4.2.1 病毒分离获得的未知毒株。4.2.2 仓鼠 肾细胞(B H K.)，使用浓度2.5 X1 0，个/m l 一 3.3 X 1 0个/ml-4.2.3 培养液基础培养液/汉克氏液(B H F/H A N K S)液十I o i t x 1 n i i 清+1 丫 Ii 1 4 A.链霉素液(最低浓度为 1 0 0 I U或p g/-L,4、保存)4-2.4 蓝舌病单克隆抗体(8 A 3 B 6,7 D 3 八 2).4 C 保存，羊(或兔)抗鼠免疫球蛋白G(I g G)辣根过氧化物酶联结合物。4.2.5 I g(;浓度1.3 m g/m I，在一2 0 C、以 下保存。4.2.6 8%的福尔马林(即 3 7%-4 0%甲醛水溶液)4.2.7 溶液配制:磷酸盐缓冲液(p H7.4)+0.0 5%吐温-2 0(P B S T)1%明胶 P B S To 底物3氨基一 9乙基咔吐(A E C)液配制方法见附录A(标准的附录)。4.3 操作程序4.3.1 9 6 孔组织培养板中加待检病毒(3.3.4.4).每个样品 I 孔，2 0 砂一 孔4.3.2 设细胞对照4 孔(加细胞生长液2 0 p I/孔)，阳性对照4 孔(加已知蓝舌 病病毒悬液2 0 I L I/孔)，阴性对照4 孔(加其他环状病毒群成员如鹿流行性出血病病毒2 0 I L I/孔、。4.3.3 每孔加入1 3 H K。细胞悬液 1 8 0 IL L(2.O X I()个/ml,),置3 7 C 5%二氧化碳中培养，逐日 观察4.3.4 当样品孔出现细胞病变时，每孔加人8%福尔马林2 0 0 I 1，室温静置1 0 m i n，移弃福尔马林和细胞培养液4.15 I H P B S T(见附录“、洗涤 易 次4.3.6 加单克隆抗体(8 A 3 B G+7 D 3 A 2;用含1 0r明胶的P B S T作1:5 稀释)5 0 I C I/孔，放于 湿盒中，3 7 C,0 育 9 0 mi n.4.3.7 用 P 1 3 S T洗涤 5 次。4.3.8 加酶结合物(抗鼠1 g G辣根过氧化物酶结合物，用含t%明胶的P B S T作t:1 0 0 0 稀释)5 0 k 1,/孔，放于湿盒中，3 7 C，反应 9 0 m m o4.19 加底物(A E C),14孔 1 0 01,1，室温静置3 0 m i n用倒置显微镜观察 4.4 判定 阴性对照、细胞对照不着色，而阳性对照中的感染细胞被染成红棕色时，试验成+Y _样.异 t，1 有红棕色细胞，则判别为阳性 表明此样品为蓝舌病病毒)，否则，判为阴性G B/r 1 8 6 3 6 2 0 0 25 抗原捕获酶联免疫吸附试验(n t i g e n c a p t u r e E I,1 S A)5.15.1.12 0 0 1,15.1.2板仪5.25.2.15.2.25.2.35.2.4器械和设备 9(t 孔高吸附性酶标实验板 单道加样器(0.5 l,-1 0 p L,5 I d,-4 0 1,1,4 0 I d,-2 0 0 p L,一 1 0 0(卜I，及滴头 八道加样器(5 0 川,1 0 0 刃,1 5 0 川,2 0 0 川)及滴头，稀释试剂用小瓶。普通杠;温箱(3 7 C)，水浴箱(3 7 C)，魂(、一2 0 冰箱，微量振荡器，混合仪，酶标洗板仪及酶标读试剂 与材料 捕捉杭体:牛抗蓝舌病病毒 2 3(B T V-2 3)型抗体，一2 0(保存 检测杭体:兔抗蓝禹 病病毒2 0(B T V-2 0)t 9 核芯抗体，一2 0(保存 结合物:抗兔I g(;辣根过氧化物酶结合物，4(、保存。溶液配制:碳酸盐缓冲液(p H 9.4).乙酸 柠檬酸盐缓冲液(p -1 6.0);磷酸盐缓冲液(p l 1 7.4)四甲荃联苯胺储存液(室温避光保存);3()%过氧化,L(I 1,();含脱脂奶的P B S T(P I 3 S I-S M)配制方法见附录B(标准的附录)5.2.5 9 一1 1日龄鸡胚。5.3 样品处理5.3.1 对细胞培养物样品不需特殊处理 使用前用 P E S T对倍稀释。5.3.2 对临床样品的处理方法见 3.3.1 05.4 实验设计和样品编号5.4 门侮个样.昂2 孔，同时设蓝舌病病毒-1(B T V-I),蓝舌病病毒 2 3(B I V-2 3)阳性对照各2 孔，阴性对照 2 孔(对照已知蓝舌病阳性和阴性细胞培养物或鸡胚肝脏悬液)。5.4.2 包被:用碳酸盐缓冲液(见B i)对捕捉抗体作 1。倍稀释，加人酶标实验板5 0川/孔，置密闭湿盒中，4(过夜5.4.3 用 P B ST(见 B T)洗涤 5 次并晾十。5.4.4 加待检样品:按实验设计铸孔加样 5 0 I,l后，室温静置6 0 mi n，再在 3 7 C 振荡3 0 m m5.4.5 用P B S T洗涤 5 次。5.4-6 加检测抗体 用B P S T-S M(见B 2)对检测抗体作1:2 0 0 0 稀释，每孔5 0 p l加人实验板，3 7(振荡3 0 m i n.5.4.7 用 P B S T洗涤 5 次5.4.8 加酶结合物:用B P S T-S M 对酶结合物作 T:3 0 0 0 稀释，母孔 5 0 p L加人实验板，3 7 C 振荡3 0 mi ll,5.4.9 用 P B S T洗涤 5 次5.4.1 0 加底物:按以下比例对底物进行稀释,9.7 n il 乙酸 柠檬酸缓冲液十5 0 川3 0%过氧化氢+3 0 0 IC I 四甲基联苯胺储存液(见附录C),每孔5 0 川 加人实验板，3 7 避光反应1 0 m i n-1 5 m i n，用2 m o l/!的硫酸5 0 1,1,/孔 终止反应。5.4.1 1 在酶标读板仪读取 2 8 0 n m波长的吸光度值