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H G 3 6 1 5-1 9 9 9前言 本标准是根据我国以往制定的苏云金杆菌企业标准等有关材料，结合我国实际情况而制定的 本标准对苏云金杆菌悬浮剂的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从而为苏云金杆菌的生产提供了统一的技术依据。本标准由中华人民共和国原化学工业部技术监督司提出。本标准由化学工业部沈阳化工研究院归口。本标准主要起草单位:中国农业大学应用化学系。本标准参加起草单位:湖北省生物农药工程研究开发中心、济南科贝尔生物工程有限公司。本标准主要起草人:刘丰茂、王开梅、钱传范、钟连胜、赵欣听、王绮文。1 1 7 2中华人民共和国化工行业标准H G 3 6 1 8 一1 9 9 9苏云金杆菌悬浮剂B a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s s u s pen s i o nc o n 亡 e n t rat e 苏云金杆菌(B ac il l usth urin gl ensi s，B.t.)是目 前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴抱晶体中的毒素蛋白，其中，对鳞翅目 有毒力的蛋白相对分子质量为1 3 0 0 00。范圈本标准规定了苏云金杆菌悬浮剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运。本标准适用于由苏云金杆菌原药和助剂制成的苏云金杆菌悬浮剂，主要用于防治鳞翅目害虫。2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所有版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。G B/T1 2 5 o 一1 9 8 9 极限数值的表示方法和判定方法 G B/T1 6 0 1 一1 9 9 3 农药p H值的测定方法 G B/T1 6 0 4 一1 9 9 5 商品农药验收规则 G B/T1 6 0 5 一1 9 7 9(1 9 8 9)商品农药采样方法 G B3 7 9 6 一1 9 8 3 农药包装通则 G B/T1 4 8 2 5 一1 9 9 3 农药可湿性粉剂悬浮率测定方法 G B/T1 6 1 5。一1 9 9 5 农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法 H G3 6 1 7 一1 9 9 9 苏云金杆菌原粉3 要求3.1 外观:棕黄色至褐色悬浮液体。3.2 苏云金杆菌悬浮剂还应符合表 表 11 要求。苏云金杆菌悬浮剂控制项目指标项目指标s 0 0 0 I U/“L4 0 0 0 IU/尸 L20 0 0l U/朴 L毒家蛋白，%)0.80。40.2毒力效价(P x l tJ 小L H a l u 加L )80 0 040 0 020 0 0p H值范围0.4.5 6.5细度(1 5 0 料 m).%)9 8悬浮率(有效成分)，%)8 0注:P x 和H a 分别为小菜蛾(Pl u t e l l a x y l o s t e l l a)和相铃虫(Hel io t h i s a 恤娜r a)的缩写。国家石油和化学工业局 1 999 一 0 6 一 1 6 批准2 0 0 0 一 0 6 一 0 1 实施11 7 3HG 3 6 1 8 一1 9 9 94 试验方法 除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液。4.1 抽样 按照G B/T 1 6 0 5-1 9 7 9 09 8 9)中第四章“乳剂和液体状态的采样”进行，用随机数表法确定抽样的包装件数，最终抽样量应不少于 2 5 0 m L,4.2 鉴别试验 当用生物测定法检测产品质量产生疑问时，可用以下方法进行鉴定。用十二烷基硫酸钠一 聚丙烯酞胺凝胶电泳(S D S-P A G E)方法测定有效毒素蛋白的相对分子质量是否为 1 3 0 0 0 0，并同时测定毒素蛋白含量是否符合 3.2 指标的规定。4.3 毒素蛋白含量的测定 毒素蛋白含量可以用S D S-P A G E 一 扫描法和S D S-P A G E 一 洗脱比色法两种方法进行测定，二者精密度、准确度接近，前者由于自动化程度更高，而定为仲裁法。4.3.1 S D S-P A G E 一 扫描法(仲裁法)4.3.1.1 方法提要 用碱性溶液处理苏云金杆菌悬浮剂伴抱晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过S D S-P A G E，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描蛋白区带面积，进行定量。4.3.1.2 仪器、设备 电泳仪。夹芯式垂直电泳槽(1.5 m m凹形带槽橡胶模框)、凝胶板面积 1 4 5 mmX1 0 0 m m(1.5 m m,1 2 孔样品槽模具)。高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪。离心机:1 0 0 0 0 r/m i n,分析天平:精确至0.0 0 0 1 g,4.3.1.3 试剂和溶液 过硫酸铁(A P),十二烷基硫酸钠(S D S),四甲基乙二胺(T E ME D),氢氧化钠。3 0%丙烯酞胺:称取丙烯酞胺3 0 g，亚甲基双丙烯酸胺(原称:甲叉双丙烯酞胺 0.8 g，溶于1 0 0 m L蒸馏水中，过滤，于4 0C暗处贮存备用。1 m o l/L,p H 8.8 三经基甲 基氛基甲 烷-H C I 缓冲液:称取三经基甲 基氨基甲 烷3 0.2 5 g 溶于蒸馏水中.用浓盐酸调至p H 8.8，用燕馏水定容至2 5 0 m L,1 m o l/L,p H 6.8 三9基甲 基氛基甲烷-H C I 缓冲液:称取三9基甲 基氨基甲烷1 2.1 0 g 溶于蒸馏水中，用浓盐酸调至p H 6.8，用蒸馏水定容至1 0 0 m L,电极缓冲液:称取三经基甲 墓氛基甲烷3.0 3 g，甘氨酸1 4.4 2 g，十二烷基硫酸钠1 g，用蒸馏水溶解并定容至1 0 0 0 mL,3 X样品稀释液:1 m o l/L,p H 6.8 三经基甲基氨基甲烷-H C I 1 8.7 5 m L，十二烷基硫酸钠6 g，甘油3 0 mL,琉基乙醇 1 5 m L，少许滨酚蓝，用燕馏水定容至 1 0 0 mL,染色液:称取考马斯亮蓝(C B B)R-2 5 0 1 g，加人甲醇4 5 0 m L,冰乙酸1 0 0 m L,燕馏水4 5 0 m L，溶解过滤后使用。脱色液:量取甲醇 1 0 0 mL，冰乙酸 3 5 mL，用燕馏水定容至 1 0 0 0 mL1 1 7 4H G 3 6 1 8 一 1 9 9 9 漂洗液:量取无水乙醇3 0 m L，冰乙酸1 0 m L,蒸馏水6 0 m L,混合均匀后使用。毒素蛋白标样:毒素蛋白(相对分子质量为1 3 0 0 0 0)含量为9.3%的原粉。4.3.1.4 试样处理 称取标样2 0 m g(准确至。.1 m g)，移至5 m L离心管中，加2 m L水充分悬浮。量取待测试样 1 0 mL，准确称量后，用蒸馏水定容至 1 0 0 m L，充分摇匀后取 2 mL稀释液，移至5 m L 离心管中。在上述 2 m l，试样溶液中加人0.5 5 m o l/L氢氧化钠溶液0.4 5 m L(使氢氧化钠溶液的终浓度为0.1 m o l/L)，放置约5 mi n，再加人3 X样品稀释液1.3 0 m L，使最终体积为3.7 5 m L，于1 0 0 沸蒸馏水中煮6 mi n,离心(2 0 0 0 r/m i n)1 0 mi n后取上层清液，以备电泳上样。4.3.1.5 S D S-P A G E分离毒素蛋白 a)制备 8%-1 0%聚丙烯酞胺凝胶 采用不连续缓冲系统，制胶方法见H G 3 6 1 6-1 9 9 9 附录A(提示的附录)。b)上样 取上述标样溶液上层清液，于聚丙烯酞胺凝胶的上样孔中分别上样 6,8,1 0,1 2,1 4 p L(毒素蛋白含量约为3-7 p g)，作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液(毒素蛋白含量约为5 p g)，加人到上样孔中，注人电极缓冲液后，接通电源。c)电泳 电泳初期电压控制在 1 0 0 V左右，待试样进人分离胶后，加大电压到1 2 0 V，继续电泳，当指示剂前沿到达距底端 1 c m左右时停止电泳，取出胶板，在 7.5%(体积百分数)的乙酸中浸泡3 0 mi n,d)染色 将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝(C B B)R-2 5 0 染色液染色过夜。e)脱色 倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加人脱色液，于3 7 下加热使其脱色，更换几次脱色掖，直至背景清晰为止。4-3.，.6 测定 胶板经脱色后，可清晰地看到1 3 0 0 0 0 蛋白区带，用高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪扫描该区带，扫描波长为 6 0 0 nn,样品中毒素蛋白的百分含量(X)按式(1)进行计算。X 二-,Vm2 V,X 1 0 0 .(1)式中:m,从标准曲线上查得的样品中毒索蛋白的量,k g.m,-2 m L稀释液中样品的质I,m g t V,样品 最终定容体积,m L(3.7 5 m L)=v Z 注人凝胶上样孔的样品体积,p L,4.3.1.7 允许差 取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%。4.3.2 S D S-P A G E-洗脱比色法4.3.2.1 方法提要 用碱性溶液处理苏云金杆菌悬浮剂伴抱晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过S D S-P A G E.依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，再剖胶，洗脱，测定吸光度。4.3-2.2 仪器 分光光度计。其他同 4.3.1.2,1 1 7 5H G 3 6 1 8 一 1 9 9 94.3-2.3 试剂和溶液 毗吮 e 其他同4.3.1.3,4.3.2.4 试样处理 同 43144.3-2.5 S D S-P A G E分离毒素蛋白 a)制备 8%-1 0%聚丙烯酞胺凝胶 同4.3.1.5 a).b)上样 取上述标样溶掖上层清液，于上样孔中分别上样 1 5,2 0,3 0,4 0,5 0 p L(毒素蛋白含量约为7.5 2 5p 8)，作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液(毒素蛋白含盈约为1 5 p g)，加人到上样孔中，注人电极缓冲液后，接通电源。c)电泳 同4.3.1.5 c),d)染色 同 4.3.1.5 d).e)脱色 同4.3.1.5 e).4.3.2.6 测定 用手术刀刮下待测区带.放于玻璃试管中，再加2 5%毗陡(体积百分数)3.0 m L，于3 7 下振荡洗脱毒素蛋白所吸附的考马斯亮蓝(C B B)R-2 5 0，平衡后用分光光度计，以2 5%毗吮为参比，于6 0 5 n m下，测定溶液的吸光度，用式(1)计算毒素蛋白含量。4.3.2.7 允许差 取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%.4.4 毒力效价的测定 按H G 3 6 1 6-1 9 9 9 附录B(标准的附录)进行。4.5 F H值的测定 按 G B/T 1 6 0 1 进行。4.6 悬浮率测定4.6.1 测定步骤 样品招匀后取 5.0 0 m L(精确到0.0 1 m L)，于1 0 0 m L三角玻瑞瓶中，加人标准硬水 1 0 0 mL，用手左右振荡 5 0次。制得的悬浮液全部转移到2 5 0 mL具塞t筒中，用标准硬水稀释到 2 5 0 m L。按GB/T1 4 8 2 5-1 9 9 3中3.1 进行。4.6.2 计算 悬浮率(Y)按式(2)进行计算:y=1 1 1.1(C一Q)C.”.。.(2)式中:C配置悬浮液所取试样的毒力效价，I U,Q 留在I筒底部的2 5 m L悬浮液的毒力效价，I U,4.6.3 允许差 二次重复测定结果之差不得超过 1 0%.4.7 细度的测定 吸 2 0.0 0 mL试样(准确至 0.0 1 mL)，按G B/T 1 6 1 5 0-1 9 9 5中2.2 进行。1 1 7 6H G 3 6 1 8 一 1 9 9 95 检验规则应符合 G B/T 1 6 0 4 有关规定。极限数值按 G B/T 1 2 5 0 处理。6 标志、标签、包装、贮运6，产品包装应符合 G B 3 7