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CB/r 1 8 6 3 8-2 0 0 2前台 流行性乙1 q j 脑炎又称日本乙型脑炎(J a p a n e s e B e n c e p h a l i t i c)，是山流行性乙N U R炎病毒引起的一种蚊媒性人兽共患传染病 成年动物和人常呈隐性感染，幼龄动物特别是马感染后，可发生脑炎症状。妊娠母猪可引起流产、死胎及木乃伊胎，公猪翠丸肿大，儿童可发生严重的脑炎。多发生于 7-9月份。我国许多省(I li)都有本病发生，特别是六 t-f 年代，发病率最高。对人畜的健康可造成严重的威胁世界动物卫生组织和日本的资料，都采用病毒分离鉴定、免疫荧光试验、血凝抑制试验、补体结合试验、血清中和试验等进行诊断 我国对木病的研究报道较多，而比较常用的诊断方法仍是本标准规定的病毒分离鉴定、血凝抑制试验、补体结合试验 病毒分离鉴定适用于流行性乙型脑炎新疫区的确定和病畜的确诊。间接免疫荧光试验适用于可疑流行性乙型脑炎病毒标本的快速检测和病毒分离株的初步鉴定。补体结合试验，由于补体结合抗体一 般在病后2-3 周出现，5-6 周达高峰，并可维持 1 年以L，故可适用于流行性乙A 9 脑炎的较早期诊断和流行病学调查，是最常用的方法。根据当时的实际需要，可任选一种或两种检疫方法。以达到准确诊断的卜!的。本标准的实施，对提高乙型脑炎的诊断和疫情预测水平，及时采取防制措施，保证人畜健康，将起到重要的作用。本标准的附录 A、附录 B都是标准的附录 本标准由，!，华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国人民解放军农牧大学。本标准主要起草人:李佑民、宣华、李金中、刘振润。中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准流行性乙型脑炎诊断技术G B/r 1 8 6 3 8-2 0 0 2D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r e p i d e mi c e n c e p h a l i t i s B范围本标准规定 了流行性乙型脑炎的病毒分离与鉴定、间接免疫荧光试验、补体结合试验、血凝抑制试验等技术要求本标准适用于l-1 岸、产地及集散地、饲养单位(或个人)的猪、马、骡、驴、牛、羊等的流行性乙型脑炎的诊断和检疫2 病毒的分离与鉴定2 门材料准备2 门门器材:细胞培养瓶 或管)，吸管.中试管，三角烧瓶，3 7 C 水浴箱,3 7 C 恒温箱，普通冰箱及低温冰箱，离心机及离心管，研磨器械，普通光学显 微镜，G 5 级玻璃滤器，孔径。.4 5 l a m的微孔滤膜，0.2 5 m L注射器及针头。2.1.2 试剂:汉克氏(H a n k s)4,0.5%水解乳蛋白H a n k s 液，2 万 工 U/m 工青霉素液，2 万 Ix g/M L.链霉素液，7%碳酸氢钠液,1%胰蛋白酶液,1%酚红(中性)液，伊格尔氏(E a g l e)最低必要成分培养液(E ME M)，小牛血清2.1.3 小动物:小鼠(6 g-8 g)、乳鼠2 门.4 鸡胚细胞、绿猴肾传代细胞(V e r o)、仓鼠肾传代细胞(B H K,)、白蚊伊蚊C 6/3 6 传代细胞等。2-2 病毒分离2.2 门样品的采取和运送2.2 门门在流行的早期和发病的早期(即病毒血症阶段)，无菌采取病畜的血液或脑脊髓液。2.2.1.2 应在病畜死亡后 3 h内(越早越好)采取脑组织(选大脑皮质、脑干、中脑、海马回及桥脑)数小块放于灭菌玻璃瓶2.2.1.3 猪应采取流产死胎的脑组织，置冰箱内立即送检2.2.1.4 不能立即检查者，应放一2 5 C一一3 0 C冰箱，或加 5 0%甘油生理盐水，4 C 保存送检2.2.2 样品的处理2.2-2.1 血液应分离出血清或血浆。2.2.2.2 脑脊髓液可直接应用。2.2.2.3 脑组织应研磨成糊状，加入 0.5%水解乳蛋白H a n k s 液(或碱性肉汤或 1 0%脱脂奶生理S h水)，制成 1 0 写悬液，3 0 0 0 r/mi n离心 3 0 mi n，吸取 上清液，加入青霉素 5 0 0 I U/ml和链霉素5 0 0 p g/m l，在4 C 处理3 h-4 h无污染者可不加青、链霉素处理)，即得接种样品。2.2-2.42.2.32.2-3.1 怀疑有污染的样品，也可用。.4 5 la m微孔滤膜过滤法处理。动物分离法取6 g-8 g 小鼠1 0 只(或3-5日龄乳鼠 一 窝)，用左手固定，在耳与眼之间用碘酒消毒 右手持 吸 取 接 种 样 品 的 0.2 5 m l 注 射 器 在 消 毒 部 刺 人 硬 堕 些 互旦生生 二竺生 燮丝垫 些二 生鱼 塑中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局 2 0 0 2-0 2-1 9 批准2 0 0 2-0 5-0 1 实施C B/T 1 8 6 3 8-2 0 0 20.0 1 m l，一。.0 2 m l)。然后用左手拇指及食指抓住小鼠头顶部皮肤，翻转左手，使小鼠腹部朝上，将其尾部夹在左手掌与 小手指之间，消毒腹部，右手持注射器向腹腔内注人样品0.2 m 1 _-0.5 m 工。2.2.3.2 对照小鼠2只，按同法同剂量注射稀释液2.2.13 接种后 2 d-4d，如对照鼠正常，而注射样品的小鼠表现松毛、弓背、沉郁、震颤、绕圈、后肢麻痹、继而死亡者，应解剖取鼠脑组织，按 2.2.2.3 制成接种样品，按 2.2.3.1 再接种小鼠。连续 2 代接种小鼠均有发病致死者，而且未检出致病细菌时，一 方面继续传代并作鉴定，另方面用冰冻干燥法保存毒种。2.2.14 接种小鼠经7 d 1 4 d无一发病时，则取出2只，解剖取脑组织，按2.2.2.3 制成样品4传代，观察2 周如仍无死亡，即按未分离出病毒报告。2.2.4 组织培养法2.2-4.1 取 2.2.2 制成的样品，接种鸡胚细胞、仓鼠肾单层细胞或V e r o,B H K aC 6 1 3 6 传代细胞单层，每份样品至少接种1 0 管(或瓶)，每管0.1 m L 0.2 m L,3 7 C 吸附1 h，用H a n k s 液洗1 次，加人E ME M液 1 ml，放 3 7 C培养 7 d-1 0 d.2.2.4.2 同时设细胞对照2 管(或瓶)，不接种样品，其他步骤与接种样品管相同2.2-4.3 接种后观察约 1 0 d，第二天开始，每天在显微镜下观察细胞病变，若细胞对照管正常，而接种样品管细胞出现细胞萎缩、脱落 形成空斑等病变时，立即移种新的细胞单层，如出现相类似的病变，且日渐明显，即可收获，放 一 2 5 C一一3 0 c 冰箱保存待检。2.2.4.4 如盲传 3 代均无细胞病变，即按未分离出病毒报告22.5 鸡胚培养法2.2.5 门取 2.2.2 制成的样品，接种于6 d-8 d 龄鸡胚卵黄囊内，每胚接种。.5 m l，每份样品至少接种 4 胚2.2.5.2 同时设对照鸡胚 2 个，对照鸡胚接种稀释液 0.5 m工 J2.2.5.3 置3 7 C 培养4 d,4 8 h 后对照鸡胚正常，而接种样品鸡胚死亡或到期未死亡者，解剖取出鸡胚磨碎，用碱性肉汤制成1 0/o 悬液,3 0 0 0 x/m i n 离心3 0 m i n，取上清液按 2.2.3 接种小鼠，2.2-5.4 如小鼠发现2.2.3.3 中死亡时，解剖取脑组织，冰冻保存待检。2.2-5.5 如鸡胚培养3 代均正常，即按未分离出病毒报告2.2.6 病毒的鉴定 经小鼠、鸡胚或组织培养法分离获得能稳定传代的病原，在细菌培养基_ L 不生长，经除菌过滤(:5级玻璃滤器或。.4 5 u m微孔滤膜)仍保留其繁殖力和致病力，即可以认为已分离到病毒。2.2.6 门初步鉴定:将待检病毒制备抗原，用血凝抑制试验(第4 章卜补体结合试验(第5 章)作初步鉴 定，确定病毒的属性。三种方法任选一种。2.2-6.2 最后鉴定:小鼠中和试验方法如下:a)首先将被检血清5 6 C 3 0 m i n灭活;b)与1 0 倍连续稀释的乙型脑炎病毒等量混合，在 3 7 C 感作 I h;。)给3 周龄小鼠脑内接种，每只接种。.0 3 m L，每一稀释度病毒脑内接种相同小鼠5 只，观察2 周;d)根据各稀释度小鼠的死亡数和存活数按半数致死量(R e e d-Mu e n c h)法计算L D s,;。)操作中要设病毒对照组(已知参考病毒加阴性血清)，阳性血清对照组(已知参考病毒加阳 性血清);f)试验组为(被检病毒加阳性血清);9)结果判定:组L D.:-组I.D s o=阳性血清中和已知参考病毒的中和指数;组工 _ D 一组L D。二阳性血清中和被检病毒的中和指数 两者中和指数相接近(相差O.5 1,1),),即可确定分离的病毒为流行性乙型脑炎病毒如对中和指G e/T 1 8 6 3 8-2 0 0 2数结果有怀疑，可用新分离的病毒制备免疫血清，再与参考株和新分离的病毒株进行交叉中和试验。如果对应的杭原抗体反应效价高于交叉反应的效价，则表明两者有区别3 补体结合试验3.1 材料准备3 门门器材 试管(7.Se m X 1.0 c m),吸管(1 0 m 工、2 ml 1 m 丁)，试管架，水浴箱(3 7 C3 8 C)，离心机及离心管。3.1.2 试剂31.2.1 乙型脑炎抗原将病毒正常对照抗原，均由制标单位提供11.2.2 溶血素:由制标单位提供。效价应 1，5 0 0 0 以上31.2.3 补体:由制标单位提供冻干补体，或用 3 只以上豚鼠血清混合的新鲜补体。11.2.4 绵羊红细胞:由健康绵羊采血，加人三倍的阿氏液(见附录A中A 3)内，4 C 保存可用 1 个月。用前取绵羊红细胞悬液适量，加 5 -1 0 倍量的生理盐水(见附录A中A 4)，充分混匀后，以2 5 0 0 r/m i n离心1 5 m i n,吸弃 t 清液后，再加生理盐水悬浮红细胞，如此洗涤3 次。最后以2 5 0 0 r/m i n 离心2 0 m i n,吸弃土清液，沉淀的红细胞以钙镁盐水(4.1.2.7)配成 1%绵羊红细胞悬液。3.1-2.5 阳性对照血清由制标单位供应。3 门.2.6 阴性对照血清由制标单位供应。11.2.7 钙镁盐水:见附录A中Al.3 门.3 样品11.11 被检血清应于发病早期和病后4 周各采血 1 次，分离血清，密装灭菌小瓶，4 C冰箱保存或立即检查31.3.2 采血分离血清过程应无菌操作，防止污染血清须新鲜透明不溶血。11.13 试验前应将阴性血清、阳性血清、被检血清作2 倍稀释，随后依动物种类进行不同温度的加热灭活3 0 m i n.豚鼠5 6 C,马5 8(1-6()(1，人、猴及小鼠6 0 C，牛、水牛、山羊、狗、猪、仓鼠6 2 C.骡、驴6 3(、一6 4(、，家兔 6 5(。3.2 操作方法3.2.1 预备试验 见附录H(标准的附录)。3.2.2 正式 试验I2.2.1 操作程序:il)取 3 排小试管，每排 6 支。n)于第 I 排的第2-6 管内各加钙镁盐水(见附录A中A1)0.3 m l.,()2 倍稀释的被检血清。.l mL于各排第 1 管。d)于第 1 排第 2 管 2 倍稀释的被检血清加。.3 ml。)棍匀第 1 排第2 管内容物，吸取0.5 m l，分别加于第2、第3 排的第2 管，各加。-1 m l，加于第1排第 3 管余下的0.3 ml-f)混匀第 3 管内容物，如 上 连续稀释并移人第 2、第 3 排的相应管，直到第 6 管。g)结果每排形成I:2 到1:6 4 稀释度的被检血清，每管含稀释的被检血清。.1 m 工 _ 然后按表1加人乙脑病毒杭原，或正常对照抗原、钙镁盐水各。.1 m 工，再加 2 单位的补体。.2。工，振摇棍匀后置4(冰箱过夜，取出后置3 7 C 水浴3 0 m i n h)各管再加致敏绵羊红细胞悬液 0.2 m1.,3 7 C 感作 3 0 mi n后判定。G B/T 1 8 6 3 8-2 0 0 2表 1 正式试验滴加法-L。被检血清(或阴、阳性 血清)的稀释倍