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G B/r 1 8 0 9 0-2 0 0 0前言 猪繁殖和呼吸综合症(简称P R R S)是由P R R S 病毒引起的一种接触传染性疾病。各种年龄的猪均易感染。妊娠母猪感染后可引起流产、死胎、木乃伊胎及弱胎，仔猪可发生呼吸障碍和高病死率，其他猪常呈隐性感染或仅出现轻度的呼吸道症状。P R R S 病毒有欧洲型和美洲型两种主要抗原型，分别以I N和V R-2 3 3 2 为代表株，型间具有明显的抗原交叉反应性。据现有资料，我国流行的毒株为美洲型 本病几乎发生于世界各养猪国家，并于九十年代中期传入我国。由于其对养猪业的严重威胁性，国际兽疫局(1 9 9 6)已 将本病列为B 类传染病。大连动植物检疫局在国内率先开展了P R R S的研究工作，建立了具有与国际同等水平的病毒分离鉴定、间接免疫荧光试验和血清中和试验等诊断方法。其他单位也相继建立了多种酶联免疫吸附试验等 本标准是在综合我国科研成果的基础上，参照国际兽疫局(O I E)编写的 哺乳动物、禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册(第三版，1 9 9 6)编写的。其技术内容与O I E所推荐的基本一致。本标准的附录A、附录B和附录C都是标准的附录。本标准由农业部提出。本标准起草单位:中华人民共和国大连动植物检疫局。本标准起草人:孙颖杰、苏永生、潘凤城、孙延峰、简中友。中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准猪繁殖和呼吸综合症诊断方法D i a g n o s t i c m e t h o d s o f p o r c i n e r e p r o d u c t i v e a n d r e s p i r a t o r y s y n d r o meG B/T 1 8 0 9 0-2 0 0 01 范围 本标准规定了猪繁殖和呼吸综合症(P R R S)的诊断方法。本标准适用于猪繁殖和呼吸综合症的诊断。2 诊断方法的种类和选用 P R R S 的诊断方法有多种。依据临床症状和病理变化只可 作出初步诊断，确诊必须依靠实验室检查。目 前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验U P MA)、间接免疫荧光试验(I F A)、间接酶联免疫吸附试验(间接E L I S A)和血清中和试验(S N)等。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。其余4 种方法主要用于检测P R R S 病毒抗体 I P MA,I F A和间 接E L I S A三者特异性相似，但以间 接E L I S A的敏感性最高。应用这三种方法一般不易区别病毒的抗原类型，故多适用于确定病性。S N反应具有明显的抗原型别差异，因此，它既适用于确定病性，也适用于鉴定病毒的抗原类型。中和抗体出现最晚，不适合于早期诊断 本标准指定上述五种实验室诊断技术为我国进出境和国内生猪P R R S的诊断方法，保证了我国对P R R S 的诊断与国外的一致性。在实际应用时，可根据需要和条件，从中选用1.2 种方法即可。3 病毒的分离与鉴定3 门材料准备3.1.1 器材:9 6 孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳(C O Q)恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径。.2 h e m的微孔滤膜、普通光学显微镜。3.1.2 试剂:R P M1 1 6 4 0 营养液、犊牛血清、青霉素(1 0 I U/m l)与链霉素(1 0 0 p g/m L)溶液,7.5%碳酸氢钠溶液等。3.1.3 细胞培养物:猪原代肺泡巨噬细胞培养物(P A M)或MA R C-1 4 5 或H S 2 H细胞。P A M 由无P R R S 猪获取，并经批次检验合格，制备和检验方法见附录 B.MA R C-1 4 5 或H S 2 H细胞由国家指定单位提供3 门.4 样品3.1.4.1 样品的采取和送检:在发病早期，无菌地采取病猪的血清或腹水 对病死猪(如流产的死胎)和扑杀猪(如弱胎猪)，应立即采取肺、扁桃体和脾等组织数小块，置冰瓶内立即送检。不能立即检查者，应放一2 5 C 一一 3 0 C 冰箱中，或加5 0%甘油生理盐水,4 保存送检3.1.4.2 样品的处理:血清和腹水可直接使用。肺、脾和扁桃体等组织可单独使用，也可混合后使用。各组织剪碎后研磨成糊状，加入R P M 1 1 6 4 0 营养液，制成1 0%悬液，3 0 0 0 X g 离心1 5 m i n，吸取上 清液，加入 青霉素5 0 0 I U/m l、链霉素5 0 0 v g/m l国家质t技术监督局2 0 0 0 一 0 4 一 2 6 批准、庆大霉素5 0 0 p g/m l和两性霉素B 2 0 0 p g/m 1。怀疑有细菌 2 0 0 0 一 1 0 一 0 1 实施G B/r 1 8 0 9 0-2 0 0 0污染的样品，也可用0.2 p m微孔滤膜过滤处理3.2 操作方法3.2，稀释样品:取 9 6 孔细胞培养板每孔加入细胞培养液R P M1 1 6 4 0含犊牛血清 l o 0 o,青霉素1 0 0 I U/m I、链霉素1 0 0 p g/m L、庆大霉素5 0 p g/m I、两性霉素B 1 0 p g/m L,p H=7.2)9 0 p.L，在A l 和C 1 孔内加人同一 份已处理的样品各1 0 p L(样品l o x 稀释)。将板轻轻摇动后，从A l 和C 1 排孔各取1 0 L L 分别移入B I 和D l 排孔内(样品l o o x 稀释)。除第6 和第1 2 列留作正常细胞对照外，其他各孔的样品稀释方法同上。振动稀释板后加盖，置4 C 冰箱内保存备用。3.2.2 制备细胞板:已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离物特别是欧洲型病毒株的良 好生长，因此病毒分离应首选 P A M 细胞，先将P A M细胞泥用细胞培养液 R P M1 1 6 4 0稀释，使细胞终浓度为1 X 1 0 细胞/m L。或将MA R C-1 4 5 或H S,H细胞用ME M细胞营养液稀释，细胞终浓度为5 X1 0 细胞/m l。然后，在另一块9 6 孔细胞培养板上每孔加入上述细胞悬液1 0 0 V L,按照土述操作，每板可检测2 0 份样品，每份样品重复2 个滴度第6 和第1 2 列留作正常细胞对照(不接种样品)3.2-3 接种样品:由样品稀释板每孔内各吸取稀释的样品液5 0 p L，接种于已形成细胞单 层的细胞板相应的孔内(第一代)。细胞板加盖后，放入3 7 0C 5%二氧化碳保湿恒温箱中 培养，每天观察致细胞病变作用(C P E)，连续观察2 d-5 d,C P E通常在接种后1 d-4 d 内出现，主要呈现细胞圆 缩、聚集、固缩，最后溶解脱落3.2.4 培养物盲传:根据第一代培养物C P E出现的情况(通常在接种后的第2 d-3 d)安排盲传。盲传时，不论C P E有无，一律各取孔内 混悬液2 5 P L，移入新细胞板相应的孔内。再于3 7 0C 5 环 二氧化碳保湿恒温箱中培养2 d-5 d，每夭观察C P E.13 结果的判断和解释 在第二代培养结束时，不论是否出现C P E，对所有的孔必须采用免疫过氧化物酶单层试验Q P MA)或间 接免疫荧光试验Q F A)进行终判;只 要对P R R S 病毒阳 性血清呈现阳 性反应，则被认定为P R R S 病毒分离阳性。4 免疫过氧化物酶单层试验(I P MA)41 材料准备4 门门器材 微量移液器、倒置显微镜等。4-1.2 试剂4.1-2.1 I P MA诊断板的制备:见附录B o4.1.2.2 标准阳性血清、标准阴性血清和兔抗猪过氧化物酶结合物均由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度4.1.2.3 洗涤液、血清稀释液和显色/底物溶液依照附录A自 行配制4.1.3 样品:采集被检猪血液 分离血清，血清必须新鲜透明不溶血无污染，密装于灭菌小瓶内，4 C 或一 3 0 C 冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作2 0 倍稀释4.2 操作方法 参照图 IG B/T 1 8 0 9 0-2 0 0 0庆门 厂 歹压，s ss s玉 翻 一 巨 口 巨二 巨二巨 一【下 门 厂 P 1巨 井S 71飞 三 压 刃 巨 巨习 巨 口 二巨 二巨 一I 吓门 巨 二 二 厂 二 二 巨 巨二 巨 卫巨 二 l 一压二 区二 巨二 二 二 二 巨;巨 口【二 二 二巨口S 2巨 石 S 2仁二 二仁口【二 口 巨 口 口巨 二巨匡习3区二【二一 巨二 巨二 匡 巨 二 匡 二巨二 巨习匹 刃 巨 夏 匡 三 二 二巨 卫 巨 匕二 三仁 二巨 二巨卫巨5S 5 一匹至 二仁 L 二 二 一巨口二匕 仁 二仁 二ABCDEFGHV,V w V V w V V V V V,V V-感染P R R S 病毒的细胞列戊一 未感染P R R S 病毒的细胞列;C 一空白 对照孔出一标准阳性血清对照孔;N 一 标准阴 性血清对照孔;S 1,S 2,S 3 等一被检血清编号 图1 I P MA和I F A诊断板加样示意图4.2.1 取已 作2 0 倍稀释的被检血清加入I P MA诊断板同一排相邻的2 个病毒感染细胞孔(V )及其后的1 个未感染细胞孔(V-)内(参照图1)，每孔5 0 P L，同时设立标准阳性血清、标准阴 性血清和空白对照，以血清稀释液代替血清设立空白 对照.封板并于4 条件下过夜。4.2.2 弃去板中液体，用洗涤液洗板 3 次，每孔 1 0 0 p L，每次1 m i n-3 m i n，最后在吸水纸上轻轻拍干。4.2.3 每孔加人工作浓度的兔抗猪过氧化物酶结合物5 0 p L，封板后放在保湿盒内于3 7 C 恒温箱中感作6 0 m i n.4.2.4 弃去板中液体，洗涤三次，方法同4.2.2,4.2-5 每孔加入显色/底物溶液5 0 I L，封板于室温(1 8 C-2 4 C)下感作3 0 m i n,4.2.6 弃去板中液体，洗涤 1 次，方法同4.2.2，再用三馏水洗涤2 次，最后在吸水纸上轻轻拍干，待检。4.3 结果判定与解释 将I P MA诊断板置于倒置显微镜下判读。在对照标本都成立的前提下，即空白对照感染细胞孔(P V,)和未感染细胞孔(P V-)均应为阴性反应;标准阳性血清对照感染细胞孔(P V)应呈典型阳性反应，未感染细胞孔(P V-)应为阴性反应;标准阴性血清对照感染细胞孔(N V )和未感染细胞孔(N V-)均应呈阴性反应;被检血清未感染细胞孔(V-)不应出现阳性反应。被检血清标本的细胞浆(可能仅见于部分细胞)出现弥漫状或团 块状棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阳 性，记作I P MA(+);无棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阴 性，记作I P MA(一)。I P M A(+)者表明被检猪的血清中含有P R R S 病毒的抗体。5 间接免疫荧光试验(I F A)5.1 材料准备5 门门器材:荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等5.1.2 试剂5.1-2.1 I F A诊断板的制备:见附录B.5.1.2.2 兔抗猪异硫氰酸荧光黄(F I T C)结合物、标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供5.1.3 样品:采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内,4 C或一3 0 冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用P B S 液作2。倍稀释5.2 操作方法5.2-1 取I F A诊断板，编号，弃去板中的乙醇溶液，置超净工作台中风干，每孔加1 0 0 FA-P B S 液洗-次，弃去P B S 液并在吸水纸上轻轻拍干。G B/T 1 8 0 9 0-2 0 0 05.2.2 在编号对应的孔内加入2 0 倍稀释的被检血清:同一排相邻的感染细胞孔 2 个及其后无感染细胞孔 1 个，每孔1 0 0 川，同时做标准阴、阳性血清及空白对照，空白对照是用P B S 液代替血清。置3 7 C恒温箱中感作4 5 m i n,