农业部869号公告-7-2007 转基因植物及其产品成分检测 抗虫和耐除草剂玉米TC1507及其衍生品种定性PCR方法.pdf

农业部869号公告一7一2007转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米TC1507及其衍生品种定性PCR方法1范围本标准规定了转基因抗虫和耐除草剂玉米TC1507转化体特异性定性PCR检测方法。本标准适用于转基因抗虫和耐除草剂玉米TC1507及其衍生品种，以及制品中TC1507的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T673转基因植物及其产品检测抽样NY/T674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1zSSb基因SSIb gene编码玉米淀粉合酶异构体STS2的基因。3.2TC1507转化体特异性序列event-specific sequence of TC1507外源插入片段3端与玉米基因组的连接区序列，包括Pt基因3端部分序列和玉米基因组的部分序列。4原理根据转基因抗虫和耐除草剂玉米TC1507转化体特异性序列设计特异性引物，对试样进行PC扩增。依据是否扩增获得预期279bp的DNA片段，检测试样中是否含有转基因抗虫和耐除草剂玉米TC1507.5试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。5.1琼脂糖5.210g/L溴化乙锭溶液称取1.0g溴化乙锭(EB),溶于100mL水中。注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5.310mol/L氢氧化钠溶液农业部869号公告一7一2007称取氢氧化钠(NaOH)80.0g,先用160mL水溶解后，再加水定容到200mL。5.4500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0)】称取18.6g乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Na2),加入70L水中，再加人适量氢氧化钠溶液(5.3)，加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液(5.3)调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min。5.51mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(pH8.0)称取121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tis)溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20minm。5.6TE缓冲液(pH8.0)分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(5.5)和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液(5.4)，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min。5.750TAE缓冲液称取242.2g三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用300mL水加热搅拌溶解后，加100mL乙二铵四乙酸二钠溶液(5.4)，用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1TAE。5.8加样缓冲液称取250.0mg溴酚蓝，加10mL水，在室温下溶解12h:称取250.0mg二甲基苯腈蓝，用10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，用30mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至100mL,在4下保存。5.9DNA分子量标准可以清楚的区分50bp1000bp的DNA片段。5.10dNTs混合溶液将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。5.11 Taq DNA聚合酶(5U/L)及PCR反应缓冲液5.12引物5.12.1SSb基因。SSI6-F:5-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3;SSII6-R:5-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3;预期扩增片段大小为88bp5.12.2TC1507转化体特异性序列。TC1507-F:5-CTTGTGGTGTTTGTGGCTCT-3;TC1507-R:5-TGGCTCCTCCTTCGTATGT-3;预期扩增片段大小为279bp。5.13引物溶液用TE缓冲液(5.6)分别将上述引物稀释到10mol/L。5.14石蜡油5.15PCR产物回收试剂盒6仪器6.1分析天平，感量0.1mg。6.2PCR扩增仪。6.3电泳槽、电泳仪等电泳装置。6.4紫外透射仪。