CJT 149-2001 城市供水 亚硫酸盐还原厌氧菌(梭状芽胞杆菌)孢子的测定.pdf

CJ中华 人 民共 和 国城 镇 建 设 行 业 标 准C J/r 1 4 1-1 5 0-2 0 0 1城市供水水质检验方法标准 及编制说明和研究报告2 0 0 1 一 0 7 门 7 发布2 0 0 1 门 2 一 0 1 实施中华人民共和国建设部发 布一、城市供水水质检验方法标准S t a n d a r d me t h o d s f o r t h e e x a mi n a t i o n o f w a t e r o f u r b a n w a t e r s u p p l ycJ/T 1 4 9-2 0 0 1前言 本标准 由建设部标 准定额研究所提 出。本标准由建设部给水排水产品标准化技术委员会归口 本标准由国家城市供水水质监测网广州监测站负责起草 本标准起草人:林朝晖。本标准参加验证单位:北京监测站、上海监测站、天津监测站、深圳监测站、成都监测站及顺德监测站(省级)。中华人民共和国城镇建设行业标准城市供水亚硫酸盐还原厌氧菌(梭状芽胞杆菌)抱子的测定C J/T 1 4 9 一2 0 0 1 Ur b a n wa t e r s u p p l y-De t e r mi n a t i o n o f t h e s p o r e s o f s u l f i t e-r e d u c i n g a n a e r o b e s(c l o s t r i d i a)，.液体培养基增菌法Me t h o d b y e n r i c h me n t i n l i q u i d me d i u m范围本标准规定了用液体培养基增菌法测定城市供水及水源水中亚硫酸盐还原厌氧细菌抱子。本标 准适 用于城市供 水及水 源水中亚硫酸盐还原厌氧 细菌抱子的测定。2方法 取一定体积的水样。首先用加热法选择水样中的抱子，加热时间应足以杀死营养型细菌。将水样接种于培养液中，然后于 3 7 C土1 C 厌氧培养4 4 h 士4h。由于亚硫酸盐还原厌氧细菌能把培养液中的亚硫酸盐还原为硫化铁(t)是黑色沉淀，则培养液变黑为阳性。3 试 剂和材料I1 单一强度的基本培养基3.1.1 成分 蛋白陈l og 牛肉膏1 0g 酵母浸膏1.59 淀粉19 乙酸钠(含水)5 9 L 一 半胧氨酸盐酸盐。5 g 葡萄糖1 9 蒸馏水1 0 0 0 ML3.1.2制法 将蛋白陈、牛肉膏、乙酸钠和酵母浸膏混合于8 0 0 ml水中。用2 0 0 m l,蒸馏水制备淀粉液，步骤如下:把淀粉置于少量的冷水中调成浆糊状。把剩下的水加热至沸，在搅拌 中慢慢倒人浆糊状淀粉中。将此淀粉液与前述 8 0 0 mL混合液混合，加热至沸，使全部溶解。中华人民共和国建设部2 0 0 1 一 0 7-1 7批准 5 22 0 0 1一 1 2一 0 1实施 C J/T 1 4 9 一2 0 0 1 最后再加人葡萄搪和L 一 半肤氨酸盐酸盐，使其溶解。用 Na O H(1 mo l/L)溶液调 p H值至7.1-7.2，分装 1 0 mL培养基溶液到 2 5 m L带盖螺口玻璃瓶中.冷却后，拧紧瓶盖 1 2 1 C11 C高压灭菌1 5 mi n.3.2双强度基本 培养基 制 备双强度基本培养基的过程与单一强度的基本培养基(3.1)同，但水的体积要减少一半。将1 0 mL 或 5 0 mL双强度培养基溶液分别将在 2 5 m L或 1 0 0 ml螺 口瓶 中，1 2 1 C士1 高压下灭茵1 5 mi ne3.3 亚硫酸钠(N a 2$03)溶液 4g无水亚硫酸钠溶于1 0 0 m L水中，用。.2 p m滤膜过滤除菌。保存温度2 C-5 C。保存期 1 4天。3.4 柠檬酸铁(C,H,O,F e)溶液 7g柠檬酸铁溶于1 0 0 m L水中，用。.2 p m滤膜过滤除菌。保存温度2 C-5 C。保存期 1 4天。I5完全培养基3-5.1 分析时，将等体积的亚硫酸钠溶液(3.3)和柠檬酸铁溶液(3.4)混合。15.2 在每瓶单一强度培养基中各加人。5 mL的混合溶液(3.5.1)，此培养基应重新在沸水水浴上加热 1 5 mi n并冷却。3.5.3 在每瓶 1 0 ml的双强度培养基中各加人。4 ml的混合溶液(3.5.1),5 0 mL的双强度培养基中各加人 2m 工的混合溶液，此培养基也应重新在沸水水浴上加热 1 5 m i n并冷却。4仪 器1 0 0 mL和 2 5 ml螺口带盖玻璃瓶5 0 mL,1 0 0 ml,1 0 mL和1 mL移液管。恒温水浴锅。试管(1 5 0 m m X 1 3 m m)接种环。恒温培养箱(保持温度 3 7 C士1 C).细菌过滤器4.2们4*44.5仍4.75 测定 步骤5.1 抱 子的选择 水样在试验前须放置于7 5 C士5 C水浴锅中，加热 1 5 mi n，用同样带盖螺口瓶子作空白，检查加热温度。5.2接 种与培养 将5 0 mL水样置于含5 0 m L双强度完全培养基(3.5-3)的 1 0 0 mL螺口瓶中 向 5 个含有 1 0 MI双强度完全培养基(3-5-3)的 2 5 mL螺口瓶中，加人 1 0 mL水样。向 5 个含有 1 0 mL单一强度完全培养基(3-5.2)的2 5 mI螺Q瓶中，加人1 m L水样。如果有必要，可向5个含有 1 0 mL单一强度完全培养基(3.5-2)的 2 5 m L螺口瓶中分别加人 1 mL稀释度为 1 1 0 倍的水样稀释液。为定性检验 1 0 0 mL水样而无需进行最可能数(MP N)计算时。可向含有 1 0 0 mL双强度完全培养基(3.5.3)的 2 0 0 mL螺 口瓶 中加人 1 0 0 m1,水 样。5 3C J/T 1 4 9 一2 0 0 1 如有必要，可将 单一强度完全培 养基加至瓶颈处，以保证瓶中残 留极 少量 的空气。拧紧瓶盖，将瓶密封，于无氧条件下培养。在 3 7C士IC培 养 4 4h 土4h。注意:由于培养中可产生气体，在密封的大体积玻璃容器中培养时可能发生爆炸，应选用较坚固的玻璃容器。在接种前，将烧红的铁丝置于瓶内培养基中密封，可有助于厌氧培养。5.3观察结果 瓶子内部变黑 为阳性。6计数及报告 结果 根据试验阳性的瓶数，查M尸 N 表(见表1和表 2).即可得 1 00 mL水样中的亚硫酸盐还原厌氧细菌抱子数，乘 10 即为 100om l水样中的亚硫酸盐还原厌氧细菌抱子数。表 1 亚硫酸盐还原厌氧细菌抱子最可能数(M尸 N)检数表 (总 接 种 量 1 O s mL，其 中 1 份 6 Oml 水 样、5份 10 mL水 样、5 份 I lnl 水 样)接种量，ml。p、一接种量，TnLM PN、5 0l O1“。m )一5 Ol Ol(每 l o oml)OOO 1 吕 0l2O一 几 一C J/T l 日 9 一2 0 0 1 表 2 亚硫酸盐还原厌氧细菌抱子最可能数。f Z N)检数表 总接种量5 5.smL，其中5份 10mL水样、5份lmL水样、5 份 0.lm L水样)接种量，mLM P N接种量，mL五 刀 N1 O10.1 每 。m L，一1 0l0.1(每 1 0 0mL)OO0 1 8 0 0 2.滤膜法2.Me t h o db y me mb r a n e f i l t r a t i o n1 范 围本标准规定了用滤膜法测定城市供水及水源水中亚硫酸盐还原厌氧细菌抱子本标准适用 于城 市供水及水源水 中亚硫 酸盐还原厌氧细菌抱子 的测 定。5 兄C J/T 1 4 9 一2 0 0 12方法 取一定体积 的水样。首先用加 热法选择水样 中的抱子，加热时间应 足以杀死 营养型细菌。把 水样 通过滤膜过滤，使细菌抱子截留于膜上。将滤膜置于专用的选择性培养基(亚硫酸盐一 铁一 琼脂)上，于3 7 C士I C 厌氧培养 2 0 h 士4h及 4 4 h 士4h，计数黑色菌落。试剂和材 料1 亚硫酸盐 铁一 琼脂1.1 基本培养基1.1.1成分八嘴J口J月 牛肉膏39 蛋白陈1 0g 氯化钠s9 琼脂1 5 g 蒸馏水1 0 0 0 mL3.1.1.2制法 把上述各成分，在水浴中加热至溶解，再以蒸馏水补足至 1 L，用 1 mo l/L的氢氧化钠溶液调p H值至7.6 士。.1，然后每一试管中注人 1 8 mL培养基，1 2 1 C土1 C高压灭菌2 0 mi n,凝固后保存于冰箱中。3.1.2 无水亚硫酸钠(N a 2 S O3)溶液:1 0g无水亚硫酸钠溶于 1 0 0 mL水中，用。.2 h e m滤膜过滤灭菌。保存温度2 C-v 5 Y。保存期 1 4 天3.1.3 硫酸亚铁(F e S 04)溶液:8g晶体硫酸亚铁溶于 1 0 0 m L水中，用。2 K m滤膜过滤灭菌。保存温度 2 C-5 C。保存期 1 4天11.4 完全培养基 在基本培养基(3.1.1)使用前，先将其融化，然后向含有 1 8 mL基本培养基的试管中注人 1 mLN a 2 S O溶液(3.1.2)和 5 滴 8%硫酸亚铁溶液(3.1.3)03.2 替代培养基胰蛋白诉 亚硫酸盐一 琼脂培养基3.2.1成分 胰蛋白加;(T r y p t o s e)1 5 g 大豆蛋白陈(S o y t o n e)5 g 酵母浸膏5g 焦亚硫酸钠(N a,S,O,)1 g 柠檬酸铁按(F e 十)1 g 琼脂1 5 g 蒸馏水1 0 0 0 m112.2制法 上述成分置于约 9 0 0 m l,蒸馏 中在水浴中加热至溶解，再以蒸馏水补足至 1 L，在 2 5 C时用I mo l/I的氢氧化钠溶液调p H值至7.6 士。.1，然后注人试管中，每管培养基 1 8 m L,1 2 1 C土I C高压灭菌1 5 mi n o 4 C-5 C保存，保存期为两星期4仪器4.1 三角瓶(2 L)4.2 试管(1 6 0 mm X 1 6 mm)4.3 移液管(1 0 m L)5 6C J/T 1 4 9 一 2 0 0 14.4 烧杯(1 L)4.5 水浴锅4.6抽滤设备4.7无齿镊子4.8 滤膜(孔径0.2 e m)4.9 培养箱(保持温度 3 7 C士1 C)4.1 0 培养皿4.1 1滤膜过 滤器5 测定 步骤51 滤膜 灭菌 将滤膜放人烧杯 中，加人蒸馏水，置 于沸水浴 中煮沸灭菌 三次.每次 1 5 mi n。前两 次煮沸后需要更换 水洗涤 2-3次，以除去残留溶剂。5.2 滤器灭菌，视滤器质地采用于热(酒精棉球火焰)或湿热灭菌。5.3抱子 的选择 水样在试验前须放置于水浴锅中，7 5 C士5 C 加热 1 5 m i n。用同样的水样瓶作空白，用温度计检查加热温度。5.4接种 与培 养 水样的过滤量要适当:对于饮用水、泉水、井水、海水、地面水和梭状芽抱杆菌轻度污染的水，取1 0 0 ml,过滤;对污染严重的水或废水，可用无菌水稀释后检测。调配一定的稀释度，使在滤膜上生长的黑色菌落分离，而更易于计数。水样过滤后，用无菌镊子将滤膜过滤面朝下，置于培养皿中，同时使滤膜下无气泡。小心地将 1 8 mL约 5 0 C的完全培养基(3.1.4)或替代培养基(3.2)倾注于培养皿中的膜上。在形成培养基层后，3 7 土1 C厌氧培养2 0 h 士4 h和 4 4 h 土4h。如果使用厌氧瓶或厌氧培养箱，滤膜可放置在琼脂面上，且滤膜面向上。5.5观察结果 培养 2 0 h士4h和 4 4 h士4h后，计数所有黑色菌落。6 分 析结果的表述 试验报告应说明所使用的方法，单位体积水样中亚硫酸盐还原厌氧细菌培养 4 4 h 土4 h的抱子数;抱子数太多，黑色菌落连在一起而难以计数，可采用2 0 h 士4h培养时间的抱子大约数 目。结果以C F U/1 0 0 MI计。