GHT 1313-2020 蜂蜜中甘油含量的测定 高效液相色谱法.pdf

ICS 67.180.10 CCS X31 中 华 人 民 共 和 国 供 销 合 作 行 业 标 准 GH/T 13132020 GH 蜂蜜中甘油含量的测定 高效液相色谱法 Determination of glycerol in Honey High performance liquid chromatography method 2020-12-07 发布 2021-03-01 实施 中华全国供销合作总社 发 布 GH/T 13132020 1 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由中华全国供销合作总社提出。本文件由全国蜂产品标准化工作组（SAC/SWG2）归口。本文件起草单位：杭州碧于天保健品有限公司、秦皇岛海关、安徽蜜之源食品集团有限公司、北京百花蜂业科技发展股份公司、浙江省食品药品检验研究院、中国蜂产品协会蜂蜜专业委员会。本文件主要起草人：周萍、尹志红、李学民、李加芬、叶发金、殷客卿、郭利军、李樱红、谭丽蕊。GH/T 13132020 2 引 言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，涉及到本文件给出的测定方法的申请专利（CN201910237161.5）的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：专利持有人：杭州碧于天保健品有限公司。地址：浙江省杭州市桐庐县桑园路 18 号。请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。GH/T 13132020 3 蜂蜜中甘油含量的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了蜂蜜中甘油含量的高效液相色谱测定方法。本文件适用于蜂蜜中甘油含量的测定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理 试样溶解后经吸附分散，提取，蒸干，复溶，液相色谱分离，示差检测器检测，内标法定量。5 试剂与材料 除非另有规定，所有试剂均为分析纯，试验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规定要求。5.1 乙醇（CH3CH2OH，95%）。5.2 微粉硅胶（SiO2，99%）：医药级，粒径45m。5.3 赤藓糖醇（CH2OHCHOHCHOHCH2OH，CAS 号：149-32-6，99%）。5.4 乙腈（CH3CN）：色谱纯。5.5 甘油（CH2OHCHOHCH2OH，CAS 号：56-81-5，99%）：标准品。5.6 内标溶液（100 mg/mL）：称取 1 g 赤藓糖醇（5.3），精确到 0.1mg，于 10 mL 容量瓶中，用少量水稀释、溶解，加 1 mL 乙醇，摇匀，用水定容至刻度。密封，08保存期 6 个月。5.7 甘油贮备液(200 mg/mL)：称取 2 g 甘油（5.5），精确到 0.1mg，于 10 mL 容量瓶中，用水定容至刻度。密封，08保存期 12 个月。5.8 甘油工作标准溶液(20 mg/mL)：取 1 mL 甘油贮备标准溶液（5.7），用水定容至 10 mL。5.9 甘油工作标准溶液(2 mg/mL)：取 1 mL 甘油工作标准溶液（5.8），用水定容至 10 mL。5.10 乙腈水溶液（9+1）：量取 90 mL 乙腈与 10 mL 水混合均匀。5.11 空白样品：取空白样品、添加 50 mg/kg 甘油的空白样品，按本文件规定的方法进行测定，添加GH/T 13132020 4 50 mg/kg 甘油的空白样品的甘油峰面积（S）与空白样品甘油保留时间处的峰面积（N）的比值（S/N）应大于 10。密封，08保存期 6 个月，-18以下保存期 24 个月。6 仪器和设备 6.1 高效液相色谱仪：配有示差折光检测器。6.2 分析天平：感量为 0.1 mg 和 0.01g。6.3 电热板。6.4 超声波清洗器。6.5 离心机：转速4000 rpm。6.6 滤膜：0.22 m，有机相型。6.7 蒸发皿：90 mm。6.8 茄形瓶：50 mL。6.9 单通道可调移液器：量程为 1 mL，5 mL。6.10 玻璃离心瓶：50 mL。6.11 容量瓶：10 mL。6.12 量筒：200 mL，1000 mL。7 试样制备与保存 7.1 试样的制备 对于无结晶试样，搅拌均匀。对于结晶的样品，在密闭的情况下，放置于不超过 60的水浴中直至全部融化，冷却至室温，搅拌均匀。7.2 试样保存 将试样于阴凉、通风、干燥环境下保存。8 测定步骤 8.1 试样溶液的制备 称取蜂蜜样品 5.0 g，精确至 0.05 g，于 90 mm 蒸发皿中，分别加入内标溶液（5.6）200 L，水 1 mL，乙醇（5.1）5 mL，搅拌均匀至完全溶解，加入 2.5 g 微粉硅胶（5.2），搅拌充分分散，150电热板上缓缓边搅拌边蒸干，转入 50 mL 玻璃离心瓶中，加入 20 mL 乙腈（5.4），混匀，超声 20 min，每隔 5min 取出摇匀，4000 rpm 离心 3 min，吸取上清液于 50 mL 茄形瓶中，残渣中再加入 20 mL 乙腈重复提取一次，合并上清液，70下旋转蒸发至干，加 1 mL 乙腈水溶液（9+1）（5.10），超声溶解残渣，吸取溶解后的样液经 0.22 m 滤膜过滤，得试样溶液。8.2 空白基质标准曲线工作溶液的制备 GH/T 13132020 5 称取 5 份空白样品各 5.0 g，精确至 0.05 g，于 90 mm 蒸发皿中，各加入内标溶液（5.6）200 L，各加入 2 mg/mL 甘油工作标准液（5.9）125 L、250 L、500 L，20 mg/mL 甘油工作标准液（5.8）125 L、250 L，下从 8.1“水 1 mL”起依法操作，得到空白基质标准曲线工作溶液。相当于标准溶液系列浓度为 250 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L、2500 mg/L、5000 mg/L。8.3 液相色谱参考条件 色谱柱：聚合物氨基填料色谱柱（4.6 mm250 mm，5 m）；或等效色谱柱。流动相：乙腈+水=87+13。流动相流速：1.0 mL/min。柱温：35。检测池温度：35。进样量：40 L。8.4 测定 8.4.1 液相色谱测定 用空白基质标准曲线工作溶液（8.2）、试样溶液（8.1）分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以甘油与内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量。标准工作溶液及试样溶液中甘油与人标的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，甘油的参考保留时间为 6.5min，内标的参考保留时间为 9.2min，参考色谱图见附录 A。8.4.2 平行测定 按 8.1 和 8.4.1 步骤，对同一样品进行平行试验测定。8.4.3 空白试验 除不称取样品外，按 8.1 和 8.4.1 步骤进行测定。9 结果计算与表示 9.1 结果计算 试样中甘油含量（X）以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1）计算：)1(10001000mVCXS 式中：CS从甘油标准工作曲线上计算得到的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V样液最终稀释体积，单位为毫升（mL）；m样品质量，单位为克（g）。注：计算结果应扣除空白值 GH/T 13132020 6 9.2 结果表示 将符合重复性要求的两个独立测定值的算术平均值作为测定结果（mg/kg），保留三位有效数字。10 测定方法灵敏度、准确度、精密度 10.1 灵敏度 本方法定量限为 50 mg/kg。10.2 准确度 本方法在 50 mg/kg，200 mg/kg，500 mg/kg 添加浓度水平上的回收率在 94%103%之间。10.3 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。空白蜂蜜样品和甘油浓度为空白蜂蜜样品测定色谱图参见图甘油浓度为 300mg/kg 的蜂蜜样品测定色谱图参见图图 A.2附 录 A（资料性）空白蜂蜜样品和甘油浓度为 300mg/kg 的蜂蜜样品测定色谱图 空白蜂蜜样品测定色谱图参见图 A.1。图 A.1 空白蜂蜜样品测定色谱图 的蜂蜜样品测定色谱图参见图 A.2。A.2 甘油浓度为 300mg/kg 的蜂蜜样品测定色谱图 GH/T 13132020 7 的蜂蜜样品测定色谱图