TCALAS 101-2021 实验动物 东方田鼠遗传质量控制.pdf

ICS 65.020.30 B 44 中 国 实 验 动 物 学 会 团 体 标 准 实验动物 T/CALAS 101-2021东方田鼠遗传质量控制 Laboratory animalGenetic quality control of Microtus fortis 2022-01-10 发布 中国实验动物学会 2022-01-10 实施 发布 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：上海实验动物研究中心、上海市农业科学院畜牧兽医研究所、上海市计划生育科学研究所实验动物经营部。本文件主要起草人：倪丽菊、高骏、谢建芸、柏熊。全国团体标准信息平台 实验动物 东方田鼠遗传质量控制 1 范围 本文件规定了封闭群东方田鼠的命名、繁殖方法、遗传质量监测方法、遗传信息档案的管理。本文件适用于封闭群东方田鼠的遗传质量控制。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 14923 实验动物 哺乳类实验动物的遗传质量控制 3 术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。封闭群东方田鼠closed colony of Microtus fortis 经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或来源清楚，用于科学研究、教学、生产、检定及其他科学实验的东方田鼠，以非近亲交配方式进行繁殖生产，在不从外部引入新个体的条件下，连续繁殖4代及以上的种群。4 封闭群东方田鼠命名 由24个大写英文字母命名，种群名称前标明保持者的英文缩写名称，第一个字母应大写，后面的字母小写，一般不超过4个字母。保持者与种群名称之间用冒号分开。5 封闭群东方田鼠的繁殖方法 按GB 14923中4.2的规定执行。6 封闭群东方田鼠的遗传质量监测 6.1 封闭群东方田鼠的遗传质量标准 封闭群东方田鼠应符合以下要求。a）具有明确的遗传背景，来源清楚，有完整的资料（包括种群名称、来源、遗传特性及主要生物学特征等）。b）用于封闭群保种及生产的繁殖记录卡应清楚完整，繁殖方法科学合理。全国团体标准信息平台 中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）22 c）经遗传检测（微卫星DNA标记检测方法）质量合格。6.2 封闭群东方田鼠遗传检测方法及实施 6.2.1 抽样 按表1要求从每个封闭群中随机抽取东方田鼠，雌雄各半。表 1 封闭群东方田鼠遗传检测的抽样要求 群体数量 抽样数量 100 只及以下 16 只 100 只以上 30 只 6.2.2 检测方法 采用微卫星DNA标记检测方法，具体方法参见附录A。6.2.3 结果判定 群体内遗传变异采用平均观测杂合度和平均期望杂合度指标或群体在各位点的平衡状态进行评价。当平均观测杂合度和平均期望杂合度在0.50.7时，群体为合格的封闭群东方田鼠群体。对各位点在群体内的等位基因进行哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）检测，如群体在某些位点偏离平衡状态，应加强繁殖管理，避免近交。6.2.4 检测间隔时间 封闭群东方田鼠每年至少进行一次遗传质量检测。7 封闭群东方田鼠遗传信息档案的管理 a）封闭群东方田鼠的遗传信息档案应包含种群名称、来源、每年遗传监测抽样的动物个体编号、微卫星位点名称及其相对应的个体的基因型。b）分析不同世代获得的基因频率和基因型频率的差异，及时调整保种方案以保存种群的遗传多样性，避免近交系数的上升。c）一般由专人进行遗传信息档案的记录和保管，除纸制材料外，应注意电子档案的录入和备份。全国团体标准信息平台 23 实验动物东方田鼠遗传质量控制附 录 A（规范性附录）封闭群东方田鼠微卫星 DNA 标记检测方法 A.1 基因组 DNA 提取 从东方田鼠眼眶采集抗凝血200 L或剪取0.5 cm东方田鼠尾巴，用常规酚氯仿抽提法或试剂盒提取基因组DNA，测量基因组DNA的浓度与纯度，OD260/OD280应在1.71.9。将DNA溶液的浓度调整至20 ng/L，20保存备用。A.2 微卫星位点及引物信息 用18个东方田鼠微卫星位点检测封闭群东方田鼠的遗传概貌。各微卫星位点上游PCR引物的5进行荧光染料标记，根据各位点的目的片段长度、引物的荧光标记和退火温度的不同，将所有引物分为7个组合，同组内的微卫星位点可以同时扩增检测。具体引物信息见表A.1。表 A.1 东方田鼠 18 个微卫星位点的引物信息 组合 位点编号 引物序列及荧光标记 53 等位基因范围/bp 等位基因 个数 退火温度/Panel 1 MFBAC67-34 FAM-AAGCAGAGGACAGTAATGG 116156 20 54 CCTTGAACTTGGAGAATGAC MFA53 HEX-CCAGTGTATTACTGCATCTAAGC 147175 14 AGGCTGTAAGGGACCAAGT MFB41 FAM-GACCATAAAGTGAGATGCTACC 209245 15 AGTGCTGGGATTAAAACG Panel 2 MFBAC133-32 HEXATCGCCAGAATCTACATCC 192210 9 58 CCAAGTGACAGTGAGAGG MFA50 FAM-CCACTGGAGATATGAGGTGATCGT 128154 13 GGTGAATGGGAGGTGAAGAGTTTG MFBAC52-05 HEX-CTCCAGTTCCAGTCAGAG 265293 13 AAGGTCAATCTTGGTGGTT Panel 3 MFA56 HEX-CTGTCTTCTGACCTCCAAAC 119155 15 58 TCTCCCTTCACTAAACCATG MFA300 FAM-GGAGACTTACATACAGACCAAACA284310 10 GGGGAACAAACCCAGGAC MFA178 HEX-ATGTCCTATTTGGGGCTGAG 177205 15 CTGAAAACCGGGAAGGCT Panel 4 MFA73 HEX-CATGTGTTTCCTGGTGACTC 136164 15 59 TCTCCAAGTCTCCTGCTCCT MFBAC114-22 FAM-CAGGCTATCCATGCTCTC 373427 17 CGGTGACAATTCTCCTAGCAG 全国团体标准信息平台 中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）24 续表 组合 位点编号 引物序列及荧光标记 53 等位基因范围/bp 等位基因 个数 退火温度/Panel 4 MFBAC107-05 HEX-TAGTGAAGCCAACAACCAAAAT 230258 8 59 CAAGGAAGTGAGAGGAACAT Panel 5 MFA257 FAM-CTTGGTCCGCAGTAGAGTC 96138 21 57 GGTCATCAGGTTGGCTTG MFA184 FAM-CGCCTCACAGATTCTTACC 210260 17 TCTTCCCAGGAGACCCTA MFA313 FAM-AAGCAGGAATCAAACAGC 266296 15 TGGGTGTGCCTATAATCTCAG Panel 6 MFA356 FAM-GCACAATGAAGAGCCTAAG 105159 18 56 GAAGCCTTATACAGACTCCT MFBAC57-07 HEX-AGCCTCAACAGATTCTAGGAC 176202 13 CACACTATTGGCAGTCTCT Panel 7 MFA247 HEX-CACAACACCCAGGAGGAG 301341 15 57 ACTATGAGTTAGCAGGACGAC A.3 PCR A.3.1 PCR反应体系和程序 采用多重PCR扩增试剂盒进行PCR实验。PCR反应总体积为12.5 L，其中10Multi HotStart PCR Buffer 1.25 L，dNTPs（2.5mmol/L每种）1L，Multi HotStart DNA 聚合酶 （5 U/L）0.25 L，Primer Mix 1 L（各引物的终浓度为0.2 mol/L），基因组DNA（20 ng/L）2 L，纯水7 L。另加10 L矿物油覆盖防止挥发。PCR反应程序为：95预变性15 min；94变性30 s；5459退火90 s；72延伸60 s；35 个循环；72继续延伸10 min；扩增产物4保存。A.3.2 PCR产物检测 PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效率。A.3.3 PCR产物的分型 取0.5 L PCR产物和含分子量标准的上样缓冲液9L混合，95变性5 min，立即置于冰上。变性产物经自动测序仪电泳收集荧光信号后形成峰图。应用GeneMapper软件对电泳数据进行处理，确定各微卫星位点PCR产物的片段大小和基因型。A.4 统计分析 应用遗传分析软件对微卫星的分型数据进行处理，分析各位点的有效等位基因数、基因型频率、基因频率、观测杂合度、期望杂合度等，从而计算群体的平均观测杂合度和平均期望杂合度。根据Hardy-Weinberg定律，对各位点的基因型频率和基因频率进行卡方检验，可监测群体在各位点的平衡状态。A.5 结果判定 当平均观测杂合度和平均期望杂合度在0.50.7时，所检群体为合格的封闭群东方田鼠群体。在某些位点偏离平衡状态的群体，应加强繁殖管理，避免近交。全国团体标准信息平台