SZDBZ 340-2018 转基因水稻TT51-1及其产品微滴式数字PCR定量检测方法.pdf

转基因水稻 TT51-1 及其产品微滴式数字PCR 定量检测方法 Detection of insect-resistant rice TT51-1 and its derivates products using droplet digital PCR method 2018-12-10 发布 2018-12-30 实施ICS 67.050 B 04 SZDB/Z深 圳 市 标 准 化 指 导 性 技 术 文 件SZDB/Z 3402018 深圳市市场和质量监督管理委员会 发布 SZDB/Z 3402018 I 目 次 1 范围.12 规范性引用文件.13 术语和定义.14 原理.15 试剂耗材和主要仪器.15.1 试剂耗材.15.2 主要仪器.26 操作步骤.26.1 抽样.26.2 试样制备.26.3 试样预处理.26.4 DNA 模板制备.26.5 微滴式数字 PCR 反应.27 数据分析.37.1 设定阈值.37.2 质量控制.37.3 含量计算.38 结果分析与表述.39 检出限.3 SZDB/Z 3402018 II 前 言 本文件依据GB/T 1.1-2009规则编制。本文件由深圳市经济贸易和信息化委员会提出并归口。本文件起草单位：深圳市农业科技促进中心、深圳市作物分子设计育种研究院。本文件主要起草人：邓汉超、莫洁华、刘倩琪、王学林、刘晋、周向阳、侯红利、刘玉琛、金名捺。SZDB/Z 3402018 1 转基因水稻TT51-1及其产品微滴式数字PCR定量检测方法 1 范围 本文件规定了转基因水稻TT51-1及其产品微滴式数字PCR定量检测的原理、试剂耗材和主要仪器、操作步骤、数据分析、结果分析和表述及检出限。本文件适用于转基因水稻TT51-1及其产品的定量检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 农业部2031号公告192013 转基因植物及其产品成分检测 抽样 农业部1485号公告42010 转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 GOS 基因 GOS gene 一种根部表达的水稻基因，本文件中用作内标准基因。3.2 TT51-1 转化体特异性序列 event-specific sequence of TT51-1 TT51-1 外源插入片段 3端与水稻基因组的连接区序列，包括转化载体的部分序列和水稻基因组的部分序列。3.3 微滴式数字 PCR droplet digital PCR 基于单模板分子 PCR 扩增并且对每个样品中的微滴逐个检测的一种核酸样品定量分析技术。3.4 阈值 threshold 区分阳性微滴和阴性微滴的界限值。4 原理 采用水稻内标基因GOS和抗虫水稻TT51-1转化体特异性序列引物和探针，对测试样、TT51-1阳性对照、阴性对照及空白对照进行微滴式数字PCR扩增，根据阳性对照、阴性对照和空白对照确定阳性微滴和阴性微滴的阈值，分析软件自动计算测试样GOS基因和TT51-1转化体的每微升体系所含拷贝数（拷贝数浓度copies/L）。然后根据公式：转基因含量=（TT51-1拷贝数浓度/GOS拷贝数浓度）100%，计算试样中转基因水稻TT51-1的含量。5 试剂耗材和主要仪器 5.1 试剂耗材 微滴式数字PCR反应试剂盒、微滴发生卡、微滴读取油、微滴生成油、96孔PCR板。引物和探针见表1。SZDB/Z 3402018 2 表1 引物探针名称、序列及片段大小 引物名称 产物大小 序列（5-3）GOS-F 68bp TTAGCCTCCCGCTGCAGA GOS-R AGAGTCCACAAGTGCTCCCG GOS-P HEX-CGGCAGTGTGGTTGGTTTCTTCGG-BHQ1 TT51-1-F 120bp AGAGACTGGTGATTTCAGCGGG TT51-1-R GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATA TT51-1-P FAM-CGGCAGTGTGGTTGGTTTCTTCGG-BHQ1 5.2 主要仪器 分析天平（0.0001 g）、离心机、超微量紫外分光光度计、微滴发生器、微滴读取仪、普通PCR扩增仪、超纯水仪等仪器设备。6 操作步骤 6.1 抽样 按农业部 2031 号公告192013 的规定执行。6.2 试样制备 按农业部 2031 号公告192013 的规定执行。6.3 试样预处理 按农业部 1485 号公告42010 的规定执行。6.4 DNA 模板制备 按农业部 1485 号公告42010 的规定执行。6.5 微滴式数字 PCR 反应 6.5.1 反应条件 在进行微滴式数字PCR反应时需同时进行试样、阳性对照、阴性对照和空白对照的PCR反应，每个PCR反应设置4次平行。按照表2配制微滴式数字PCR反应体系，本文件用水符合GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。微滴式数字PCR扩增程序：1、95，5 min（Ramp 2/s）；2、95，30 s（Ramp 2/s）；3、58，1 min；4、Go to 2，39X；5、98，10 min（Ramp 2/s）；6、15，10 min（Ramp 1/s）。该程序为优化后的条件，可根据不同的酶作适当调整。表2 扩增反应体系 名称 储备液浓度 加样体积 反应浓度 Droplet PCR Supermix 2 10L 1 GOS-F 20 mol/L 0.9L 900 nmol/L GOS-R 20 mol/L 0.9L 900 nmol/L GOS-P 20 mol/L 0.25L 250 nmol/L TT51-1-F 20 mol/L 0.9L 900 nmol/L TT51-1-R 20 mol/L 0.9L 900 nmol/L TT51-1-P 20 mol/L 0.25L 250 nmol/L DNA 模板 10-100ng/L 2L-纯水-3.9L-总体积-20L-注：可根据使用的酶作相应的调整。SZDB/Z 3402018 3 微滴式数字 PCR 的操作按照Instruction Manual,QX100 Droplet Generator和Instruction Manual,QX100 Droplet Reader and QuantaSoft Software执行。6.5.2 对照设置 阳性对照：转基因水稻TT51-1材料或阳性质粒；阴性对照：非转基因水稻材料作为阴性对照，以非水稻的DNA作为GOS内标基因检测的阴性对照；空白对照：无菌水。7 数据分析 7.1 设定阈值 根据阳性对照、阴性对照和空白对照设定阳性微滴和阴性微滴的最优界限值。7.2 质量控制 阴性对照和空白对照的阳性微滴数小于等于3copies（拷贝数浓度反应总体积）；平行反应之中组内RSD值应不大于25%；同一样品不同重复的拷贝数重复性良好；同时满足上述三个条件，否则重新检测。7.3 含量计算 根据阳性对照、阴性对照和空白对照确定阳性微滴和阴性微滴的阈值，分析软件自动计算测试样TT51-1 转化体和 GOS 基因的每微升体系所含拷贝数（拷贝数浓度 copies/L）。然后根据公式：转基因百分比含量=（TT51-1 拷贝数浓度/GOS 拷贝数浓度）100%，计算试样中转基因水稻 TT51-1 的百分比含量。8 结果分析与表述 定量检测结果有3种情况，每种检测结果应表述如表3 表3 定量结果表述 检测结果 结果表述 百分比含量0.5%。试样中转基因水稻 TT51-1 含量为 X%0%百分比含量0.5%。试样中转基因水稻 TT51-1 含量低于 0.5%百分比含量=0%试样中转基因水稻 TT51-1 含量为 0%9 检出限 本文件方法的检测限（LOQ）为 0.5%。_