TCALAS 111-2021 实验动物 不同毒力耐多药结核菌用于体内外药效评价技术规范.pdf

ICS 65.020.30 B 44 中 国 实 验 动 物 学 会 团 体 标 准 实验动物 不同毒力耐多药结核菌 T/CALAS 111-2021用于体内外药效评价技术规范 Laboratory animal In vitro and in vivo efficacy evaluation of multidrug-resistant tuberculosis with different virulence 2022-01-10 发布 中国实验动物学会 2022-01-10 实施 发布 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：中国医学科学院医学实验动物研究所。本文件主要起草人：秦川、占玲俊。全国团体标准信息平台 实验动物 不同毒力耐多药结核菌用于体 内外药效评价技术规范 1 范围 本文件提供了利用强毒或弱毒耐多药临床结核菌株的体外最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）测定，以及小鼠模型中药效方法，包括模型制备所需要的耐多药结核菌株的筛选、体外 MIC 测定、不同毒力耐多药动物模型制备、病理学和组织菌量评价的方法。本文件适用于临床耐药结核分枝杆菌的体外药敏测试，建立体内药效评价的动物模型和评价方法，用于评价不同类型药物对不同毒力临床耐药结核分枝杆菌体内的药效。同时，该技术规范也可以作为其他临床耐药菌的体内外药效评价技术规范的参考。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB 14925 实验动物 环境及设施 国家科学技术委员会令第 2 号 实验动物管理条例 中国药典（2020 年）药物非临床依赖性研究技术指导原则（国食药监注2007643 号）3 术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。组织荷菌量组织荷菌量 bacterium burden in tissue 单位质量的组织样本中细菌的负荷量，即菌量。4 缩略语 RIF 利福平（rifampin）EMB 乙胺丁醇（ethambutol）Mtb 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）全国团体标准信息平台 中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）118 HE 染色 苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining）CFU 菌落形成单位（colony forming unit）MIC 最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration）DMSO 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide）PBS 磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline）OADC 生长添加剂 油酸清蛋白葡萄糖过氧化氢酶添加剂（oleic albumin dextrose catalase supplement）5 试剂和材料 a）灭菌生理盐水。b）抗结核的阳性对照药。c）4%稀硫酸。d）罗氏培养基、MGIT960 培养管。e）10%福尔马林溶液。f）75%乙醇。e）组织匀浆管。h）1 mL、5 mL、10 mL 移液管。e）100 L、200 L、1 mL 加样枪和枪头。j）一次性平皿。k）解剖剪、镊子。l）生物安全操作的防护用品（帽子、口罩、手套、垃圾袋、防护服、防渗漏垫等）。m）异烟肼、利福平和链霉素。6 仪器和设备 a）CO2培养箱。b）倒置显微镜。c）电动移液器。d）生物安全柜。e）组织匀浆机。f）组织切片机。g）MGIT960 分枝杆菌快速培养系统（美国 BD 公司）。7 实验方法和要求 7.1 实验室生物安全要求 药效评价用的菌株制备、小鼠的感染、解剖取样和检测按照 ABSL-3 实验室生物安全要求执行，参见 GB 19489。全国团体标准信息平台 119 实验动物 人源肿瘤异种移植小鼠模型制备技术规范 7.2 代表性耐多药临床菌株的筛选要求 筛选满足基因型、耐药表型和耐药突变位点要求的菌株，进一步进行小鼠体内毒力实验，具体方法是：用 1.0108 CFU/mL 结核耐药菌液 100 L 或 200 L 感染小鼠，以国际公认的标准药物敏感株 H37Rv 为对照，30 天内观察小鼠的死亡情况，记录小鼠半数死亡时间。结果显示：与国际标准株 H37Rv 相比，分别挑选弱毒和强毒耐多药菌株，如编号8462 和 94789 耐多药菌株作为实验用菌株。7.3 MIC 检测用的标准株 H37Rv 和耐多药菌株的制备要求 80或液氮低温保存的 Mtb 标准株 H37Rv 及耐多药结核菌 94789、8462 单细胞悬液，要求浓度为 1.0107 CFU/mL（colony forming unit/mL），用生理盐水稀释浓度调至0.5 个麦氏浊度后备用。7.4 BD MGIT960 药敏试验 7.4.1 受试物 PP 的溶解和稀释 根据药物和受试物的溶解特性，选择合适的溶质（DMSO、PBS 或水等），配成工作浓度，并用 0.22 m 滤器过滤获得无菌的药物或受试物溶液。7.4.2 对照药的溶解和稀释 对照药异烟肼、利福平和链霉素的浓度可选择 10 mg/mL。7.4.3 BD MGIT960 药敏试验工作菌液的制备标准 按照 15 稀释的 0.5 个麦氏浊度的菌种放入 MGIT960 系统中经过一次培养，培养报阳的菌液作为第二步药敏试验的工作菌液。报阳当天为第 0 天，报阳后至少培养 1 天，第 1 天或第 2 天菌液可直接作为药敏试验的工作菌液。第 35 天以后的菌液需要 5 倍稀释得到工作菌液。7.4.4 BD MGIT960 系统进行药敏试验的程序 7.4.4.1 生长对照管菌液的制备方法 需将药敏试验工作菌液 0.1 mL 加入 10 mL 生理盐水，100 倍稀释。7.4.4.2 药敏试验的试验管准备方法 取所需数量的 MGIT960 系统的培养管，每管加入 OADC 生长添加剂 0.8 mL。生长对照组每管加入生长对照菌液 0.5 mL。试验管每管 7 mL 液体中加入不同浓度的 0.1 mL 受试药液或者对照药异烟肼、利福平、链霉素等，药物浓度采用倍比稀释的方法，要求至少确定 10 个浓度梯度值。所有试验管中工作菌液为 0.5 mL/管。7.4.4.3 利用 BD MGIT960 系统检测药物的 MIC 将所有检测的管做好标记，扫描管上条形码后放入 MGIT960 培养系统，根据管号记录报阳时间和生长单位。7.4.4.4 MIC 结果的判定方法 根据不同药物浓度梯度的试验管报阳时间和生长单位，找到报阳和报阴试验管的药物浓度临界值，确定为该药物的 MIC 值。全国团体标准信息平台 中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）120 7.5 动物感染用的菌株的制备要求 a）模型制备的菌浓度要求：H37Rv 菌液稀释成浓度为 1.0107 CFU/mL，强毒耐多药结核菌株 94789 菌液稀释成 1.0105 CFU/mL，弱毒耐多药结核菌株 8462 菌液稀释成 1.0 106 CFU/mL。b）注射剂量（体积）：每只小鼠注射菌液体积为 100 L。7.6 动物体内药效评价实验程序 7.6.1 小鼠感染 a）实验小鼠要求：SPF 级 68 周龄雌性 C57BL/6 小鼠，设置空白对照组、模型对照组、对照药物组和实验组，每组 10 只。b）感染途径：小鼠尾静脉。c）感染菌液的剂量和浓度要求：1.0107 CFU/mL H37Rv 菌液 100 L、1.0105 CFU/mL 94789 菌液 100 L 和 1.0106 CFU/mL 8462 菌液 100 L。7.6.2 给药方法 a）给药途径：灌胃。b）给药剂量或体积：一般 0.2 mL，最大不超过 0.8 mL。对照药的剂量参考成人用量换算成小鼠的剂量，受试药物根据药代情况确定剂量，某些药物可按浓度梯度给药。c）给药时间、频次和周期：根据药代情况可以在感染 1 周或 2 周后开始给药，灌胃给药治疗 4 周，每周 5 次。7.6.3 药效评价 7.6.3.1 组织荷菌量定量检测方法和要求 a）取样要求：确保生物安全，要求在生物安全柜中取样。确保每只小鼠取样的一致性，每只小鼠在固定位置取相同体积或质量的组织。b）组织去杂菌的方法：要求去组织块中杂菌，避免非目标菌对菌培养的干扰。可按照生理盐水4%稀硫酸生理盐水的顺序漂洗组织，除杂菌。c）组织匀浆的稀释梯度：组织研磨液可按照 110、1100、11000、110 000的比例，进行梯度稀释，至少要有 3 个稀释梯度。d）接种的要求：分别取稀释液 50 L 或 100 L，接种至分枝杆菌的中性罗氏培养管中，每个稀释梯度均接种 3 管，做 3 个操作重复，稀释液均匀地涂布于罗氏培养基上。e）培养条件和时间：在 37 5%CO2培养箱中培养 45 周后进行菌落计数。f）计数方法：目测斜面上有清楚可见的菌落，选择斜面上菌落数量在 20100 个的培养管为最适菌落计数浓度。按照以下公式回推计算组织中菌量：斜面上菌落数稀释倍数10=每毫升匀浆液中菌量 g）同时可用 MGIT960 系统快速培养来确定组织荷菌量，按照 BACTEC MGIT960 全自动分枝杆菌系统操作指南要求，先在 BACTEC MGIT 7H9 培养管中加入 0.8 mL 添加剂，取 101稀释度的组织匀浆稀释液 500 L，加至 BACTEC MGIT 7H9 培养管中，记录出现阳性结果的最早时间称为报阳时间（time to detection，TTD），待其报阳之后，打印出报阳全国团体标准信息平台 121 实验动物 人源肿瘤异种移植小鼠模型制备技术规范 结果，进行结果分析。7.6.3.2 组织病理的检测和定量分析方法 a）样本取样要求：除去荷菌量分析的部分组织，肺、脾、肝组织用于病理病变分析。按照生物安全三级要求操作取样，在 10%福尔马林溶液中固定至少 48 h 后，确保样本中菌已固定灭活后运出至普通实验室，进行修块、制块和染色。b）按常规流程制片、切片和染色：按常规制片流程制成蜡块，蜡块切成厚度为 5 m切片，切片应尽量包含组织的最大横切面或纵切面，确保阅片视野尽量大，切片进行 HE染色，由实验动物病理学专家进行诊断和定量分析。c）病理诊断和定量分析要求：由两名以上实验动物病理学专家阅片并诊断，复核后出报告，阅片过程中对动物组别保持双盲。对病变进行定量分析，计数病变个数、利用标尺定量病变的面积，分析肺、脾和肝组织肉芽肿的个数和面积大小，通过定量化分析评估病变程度。7.6.4 药效判定方法 受试药物组分别与实验对照组（模型组）和阳性药对照组比较，综合判定受试药物组的荷菌量值和组织病变定量值是否有差异，差异有统计学意义（即 P0.05 或 P0.01 以下）认定为药物有效。结果判定的注意事项：某些药物对荷菌量的影响不一定与对病变的影响保持平行，因此，判定结果时可能出现以下 4 种结果。组织荷菌量明显降低，病变明显减轻，且都有统计学意义，可认定药物有效。组织荷菌量明显降低，组间差异有统计学意义，但病变改善不明显，可认定药物有效，主要对结核菌体内复制增殖有明显抑制作用。组织病变明显减轻，组间差异有统计学意义，但荷菌量降低不明显，可认定药物有效，主要对结核菌导致的病理损伤有明显改善作用。组织荷菌量降低不明显，病变改善不明显，可认定药物无明显效果。8 结果复核内容 a）耐药菌的体外 MIC 试验检测菌株对药物的敏感性。b）耐药菌感染小鼠模型中，药物