TCALAS 88-2020 实验动物 伪欣氏鲍特菌检测方法.pdf

ICS 65.020.30 B 44 中 国 实 验 动 物 学 会 团 体 标 准 T/CALAS 882020 实验动物 伪欣氏鲍特菌检测方法 Laboratory animal-Method for detection of Bordetella pseudohinzii 2020-12-01 发布 2021-01-01 实施 中国实验动物学会 发布 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 给出的规则起草。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：广东省实验动物监测所。本文件主要起草人：黄树武、陈梅玲、罗银珠、何丽芳、闵凡贵、王静、张钰。全国团体标准信息平台 实验动物 伪欣氏鲍特菌检测方法 1 范围 本文件规定了实验动物伪欣氏鲍特菌（Bordetella pseudohinzii）病原分离培养鉴定。本文件适用于啮齿类实验动物中伪欣氏鲍特菌的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注明日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 14926.42 实验动物 细菌学检测 标本采集 GB/T 14926.43 实验动物 细菌学检测 染色法、培养基和试剂 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 基本原理 伪欣氏鲍特菌为革兰氏阴性杆菌，在血琼脂平皿上培养可形成特殊的菌落形态，有独特的生化反应，据此可进行该菌的分离培养和检测。4 主要设备和材料 a）恒温生化培养箱。b）生物显微镜。5 培养基和试剂 a）血琼脂平皿。b）DHL 琼脂平皿。c）氧化酶试剂或试纸条。d）过氧化氢酶。e）革兰氏染色液。f）生化试验试剂：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、松二糖、松三糖、海藻糖、纤维二糖、阿拉伯糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、卫矛醇、阿拉伯醇、侧金盏花醇、三糖铁、半固体、丙二酸盐、西蒙氏柠檬酸盐、硝酸盐、尿素酶、明胶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶。全国团体标准信息平台 105 实验动物 伪欣氏鲍特菌检测方法6 检测程序 7 操作步骤 7.1 生物安全措施 实验操作及处理按照 GB 19489 的规定，由具备相关资质的工作人员进行相应操作。7.2 采样 无菌操作采取动物的呼吸道分泌物。7.3 分离培养 将样本接种血琼脂平皿和 DHL 琼脂平皿，置（361）恒温生化培养箱培养 24 h48 h。7.4 鉴定 挑选血琼脂平皿或 DHL 琼脂平皿上可疑菌落，染色镜检，镜检符合菌体特征的接种血琼脂平皿纯培养，置（361）培养 24 h。从血琼脂平皿上挑取新鲜菌落做生化反应试验。7.4.1 菌落特征 本菌在血琼脂平皿上生长良好，可形成直径为 1 mm2 mm 灰白色、圆形、表面凸起、光滑、半透明、湿润的菌落，表现为黏液的表型，本观察到溶血现象。DHL 琼脂平皿上可形成无色半透明、直径 2 mm 左右的菌落。7.4.2 菌体特征 革兰氏染色阴性，微小的杆菌（短杆菌），大小（0.20.5）m（0.52.0）m，全国团体标准信息平台 第三篇 实验动物检测方法系列标准 106 两极浓染，单个或成对排列。鞭毛染色观察到细菌纤细的杆状，有丰富的周围鞭毛，无荚膜，无芽孢。7.4.3 氧化酶试验 氧化酶试验阳性。7.4.4 过氧化氢酶试验 过氧化氢酶试验阳性。7.4.5 生化鉴定 不发酵糖醇类：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、松二糖、松三糖、海藻糖、纤维二糖、阿拉伯糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、卫矛醇、阿拉伯醇、侧金盏花醇。三糖铁反应为碱-碱反应，不产硫化氢气体。半固体动力试验阳性，丙二酸盐阳性，西蒙氏柠檬酸盐利用试验阳性，硝酸盐还原试验阴性，尿素酶阴性，明胶液化试验阴性，鸟氨酸脱羧酶阴性，赖氨酸脱羧酶阴性。7.5 与支气管鲍特杆菌比较见表 1。表 1 支气管鲍特杆菌与伪欣氏鲍特菌比较 项 目 支气管鲍特杆菌 伪欣氏鲍特菌 DHL 平板+氧化酶+三糖铁 K/K，不产硫化氢 K/K，不产硫化氢 动力+尿素酶+硝酸盐还原+/西蒙氏柠檬酸盐利用+丙二酸盐试验 +7.6 结果判定 经鉴定符合 7.4 中各项检测结果的，可判定为伪欣氏鲍特菌。8 结果报告 凡符合上述各项检测结果者作出阳性报告，不符合者作出阴性报告。参 考 文 献 Benga L,Benten W P M,Engelhardt E,et al.2014.16S ribosomal DNA sequence-based identification of bacteria in laboratory rodents:a practical approach in laboratory animal bacteriology diagnostics.Lab Anim,48:305-312.Hayashimoto N,Morita H,Yasuda M,et al.2012.Prevalence of Bordetella hinzii in mice in experimental facilities in Japan.Res Vet Sci,93:624-626.全国团体标准信息平台 107 实验动物 伪欣氏鲍特菌检测方法Hayashimoto N,Yasuda M,Gotok K,et al.2008.Study of a Bordetella hinzii isolate from a laboratory mouse.Comparative Medicine,58(5):440-446.Ivanov Y V,Shariat N,Register K B,et al.2015.A newly discovered Bordetella species carries a transcriptionally active CRISPR-Cas with a small Cas9 endonuclease.BMC Genomics,16:863.Loong S K,Mahfodz N H,Mohamad Wali,et al.2016.Molecular and antimicrobial analyses of non-classical Bordetella isolated from a laboratory mouse.J Vet Med Sci,78:715-717.Loong S K,Tan K K.,Sulaiman,S.,et al.2017.Draft genome of Bordetella pseudohinzii BH370 isolated from trachea and lung tissues of a laboratory mouse.Genom Data,12:69-70.Perniss A,Schmidt N,Gurtner C,et al.2018.Bordetella pseudohinzii targets cilia and impairs tracheal cilia-driven transport in naturally acquired infection in mice.Scientific Reports,8:5681.Spilker T,Leber A L,Marcon M J,et al.2014.A simplified sequence-based identification scheme for Bordetella reveals several putative novel species.J Clin Microbiol,52:674-677.全国团体标准信息平台