DBS50 015-2013 食品安全地方标准 食品中大红粉的检测方法 高效液相色谱法.pdf

ICS 67.050 X 20 DBS50 重庆市重庆市地方标准地方标准 DBS 50/0152013 食品安全地方标准 食品中大红粉的检测方法 高效液相色谱法 2013-06-03 发布 2013-10-01 实施重庆市卫生局 发 布 DBS 50/0152013 I 前 言 本标准的附录A、附录B、附录C和附录D均为资料性附录。本标准为首次发布。DBS 50/0152013 1 食品安全地方标准 食品中大红粉的检测方法 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了食品中大红粉的高效液相色谱检测方法。本标准适用于辣椒粉、辣椒酱、果酱、香肠、辣椒油、火锅底料及其类似食品中大红粉的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。3 术语和定义 大红粉 属偶氮系列化工合成染料。分子式：C23H17N3O2，分子量：367.4，CAS号：3789-75-1，化学名：4（2苯基）偶氮3羟基N苯基2萘甲酰胺。4 试验方法 4.1 原理 试样中的大红粉用乙酸乙酯-环己烷（1：1）提取，经凝胶渗透色谱（GPC）净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。4.2 试剂和材料 除特殊注明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。4.2.1 甲醇：高效液相色谱级。4.2.2 甲酸：高效液相色谱级。4.2.3 丙酮：高效液相色谱级。4.2.4 乙腈：高效液相色谱级。4.2.5 无水硫酸钠，经 650 灼烧 4h，备用。4.2.6 乙酸乙酯。4.2.7 环己烷。4.2.8 三氯甲烷。4.2.9 提取液及 GPC 淋洗液：将乙酸乙酯（4.2.6）和环己烷（4.2.7）等体积混合。4.2.10 大红粉标准品：纯度95%。DBS 50/0152013 2 4.2.11 大红粉标准储备液：准确称取适量大红粉标准品（4.2.10），先用少量三氯甲烷溶解，再用丙酮配制成浓度为 100g/mL 的标准储备液，于 04保存。4.2.12 大红粉标准工作溶液：根据需要用丙酮将标准储备液稀释成 0g/mL、0.01g/mL、0.02g/mL、0.04g/mL、0.08g/mL、0.16g/mL、0.32g/mL 的标准工作溶液，于 04保存。4.2.13 0.45 m 微孔滤膜，有机系。4.3 仪器和设备 4.3.1 高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器或紫外-可见光检测器。4.3.2 GPC 净化系统或手工 GPC 净化柱（制备方法见附录 A）。4.3.3 天平：感量为 0.01g 和 0.0001g。4.3.4 组织捣碎机。4.3.5 超声波清洗器。4.3.6 旋涡混匀器。4.3.7 旋转蒸发仪。4.3.8 具塞塑料离心管：50mL。4.3.9 离心机：转速不低于 4000r/min。4.4 试样的制备 将液体、半固体样品混合均匀，固体样品需粉碎，制样过程中应防止样品污染或发生待测物含量的变化。4.5 测定步骤 4.5.1 提取 4.5.1.1 辣椒粉等粉状样品、香肠等肉制品、辣椒酱、果酱：称取 5.0 g 样品（辣椒酱、果酱等含水量较大的样品称取 10 g 样品），精确至 0.01 g，于 50 mL 离心管中，加入约 25 mL 提取液（4.2.9），于漩涡混匀器上混合提取 2 min，再超声提取 15 min 后，于 4000 r/min 离心 5 min，上清液转移至 50 mL 容量瓶中。再用 20 mL 提取液（4.2.9）提取残渣，重复上述步骤，合并提取液，用提取液（4.2.9）定容至刻度，混匀，过微孔滤膜（4.2.13）后作待净化液。4.5.1.2 辣椒油、火锅底料等油状样品：称取 5.0 g 样品（精确至 0.01 g）于 50 mL 离心管中，加入0.5 g 无水硫酸钠，加入约 15 mL 提取液（4.2.9）充分振摇，于 4000 r/min 离心 5 min，将清液转移至 50 mL 容量瓶中。再用约 15 mL 提取液（4.2.9）溶解样品，重复提取两次，合并提取液，用提取液（4.2.9）定容至刻度，混匀，过微孔滤膜（4.2.13）后作待净化液。4.5.2 净化 取10 mL待净化液于GPC样品管中，用GPC仪进行净化，或者取5 mL待净化液用手工GPC柱净化（净化参考条件见附录A），收集洗脱液，于40 下旋转蒸发至干，残渣用1.0 mL或0.5 mL丙酮溶解后，过微孔滤膜（4.2.13）后待测定。4.5.3 测定 4.5.3.1 液相色谱检测条件 a)色谱柱：Zorbax Eclipse XDB C18柱，5m，4.6mm150mm（或相当型号色谱柱）。DBS 50/0152013 3 b)流动相：A：0.1%甲酸水溶液：乙腈=85:15；B：0.1%甲酸乙腈溶液：丙酮=80:20。c)梯度洗脱程序：见表 1。d)流速：1.0mL/min。e)柱温：35。f)进样量：20L。g)检测波长：500nm。表1 梯度洗脱条件 流动相 时间（min）A%B%0 25 75 10.0 25 75 25.0 0 100 32.0 0 100 35.0 25 75 40.0 25 75 4.5.3.2 液相色谱测定 按设定的色谱条件（4.5.3.1），取大红粉系列标准工作溶液（4.2.12）及样液（4.5.2）等体积进样测定，样品中待测物含量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围，应进行适当稀释后测定。在该条件下，大红粉的保留时间约为10.2 min。大红粉的高效液相色谱图及其紫外-可见光谱图参见附录B中图B.1、图B.2。必要时采用液相色谱质谱/质谱进行进一步定性确认，确认方法见附录C、附录D。4.5.3.3 空白试验 除不加样品外，按4.5.14.5.3进行。5 结果计算和表述 用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按照式（1）计算试样中大红粉的含量。10001000)(210VmVVCCx.(1)式中：x试样中大红粉的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；C由标准曲线得到的样液中大红粉的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；0C由标准曲线得到的空白试验中大红粉的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；V样液经净化后最终定容体积，单位为毫升（mL）；1V样品提取液的总体积，单位为毫升（mL）；DBS 50/0152013 4 2V用于GPC净化的样品提取液体积，单位为毫升（mL）；m试样质量，单位为克（g）。6 测定低限 高效液相色谱的测定低限为0.01 mg/kg。DBS 50/0152013 5 附录附录 A A （资料性附录资料性附录）GPCGPC 仪净化仪净化和手工和手工 GPCGPC 柱净化参考条件柱净化参考条件 A.1 GPC仪净化参考条件（1）a）凝胶色谱净化系统 GPC Ultra（LC tech）；b）净化柱规格 400 mm25 mm（i.d）；c）净化柱填料 Bio-Beads S-X3（200400 mesh）；d）GPC 淋洗液：乙酸乙酯环己烷（1:1，v/v）；e）流速：5 mL/min f）收集：弃去 0 s1600 s 的淋洗液，收集 1600 s 2000 s 淋洗液，2000 s2300 s 淋洗 GPC 柱。A.2 手工GPC柱净化参考条件 A.2.1 主要材料 a）玻璃层析柱管：1.5 cm(内径)40 cm(长度),带玻璃滤芯和活塞；b）填料 Bio-Beads S-X3（200400 mesh）；c）GPC 淋洗液：乙酸乙酯环己烷（1:1,v/v）。A.2.2 手工GPC柱装填 根据装填柱体积大小称取适量Bio-Beads S-X3 凝胶干粉，放在流动相中充分浸泡 24 h以上，将溶胀后的凝胶以湿法装入玻璃层析柱管中，用流动相淋洗柱体，使稳定后的柱床高度为 30 cm，注意使凝胶柱床始终浸泡在流动相中。A.2.3 净化参数 将手工GPC柱（A.2.2）的凝胶柱床液面放至胶床表面后，在柱下端接一量筒测定淋洗液的体积，将5 mL待净化液用滴管缓慢加到凝胶柱上层，当待净化液液面降至柱床表面后，再加入流动相淋洗。弃去前 45 mL淋洗液,收集后 20 mL淋洗液,于 40 下旋转蒸发至干，残渣用 0.5 mL丙酮溶解后，过微孔滤膜（4.2.13）后待测定。之后继续用 30 mL流动相淋洗凝胶柱后供净化下一样品用。（1）非商业性声明：附录 A 所列 GPC 仪净化参考条件是在德国 LC tech 公司的仪器上完成的，此处列出试验用仪器型号仅提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号的仪器。DBS 50/0152013 6 A A 附录附录 B B （资料性附录资料性附录）大红粉大红粉标准溶液标准溶液的的 HPLCHPLC 色谱图色谱图和和紫紫外可见光谱图外可见光谱图 大红粉的 HPLC 色谱图 0.02.55.07.510.012.515.017.5min-4.0-3.0-2.0-1.00.01.02.03.04.0mV(x0.1)0102030405060708090%Detector A:500nm 图 B.1 大红粉标准溶液的 HPLC 色谱图 大红粉的紫外可见光谱图 图 B.2 大红粉的紫外可见光谱图 DBS 50/0152013 7 B B 附录附录 C C （资料性附录资料性附录）食品中大红粉的液相色谱食品中大红粉的液相色谱质谱质谱/质谱定性确认方法质谱定性确认方法 C.1 液相色谱质谱/质谱分析条件 C.1.1 色谱柱：Hypersil Gold，2.1150 mm，3m；C.1.2 流动相：A(甲醇):B(0.1%甲酸水溶液)=80:20；C.1.3 流速：0.2 mL/min；C.1.4 柱温：35；C.1.5 进样量：10 L；C.1.6 离子源：电喷雾离子源；C.1.7 扫描方式：正离子；C.1.8 检测方式：多反应监测（MRM）；C.1.9 质谱/质谱参考条件（2）：a)鞘气流量：20 arb；b)辅助气流量：10 arb；c)雾化室温度：120；d)毛细管温度：300；e)喷雾电压：3000 V；f)定性离子对、碰撞能量见表 C.1。表 C.1 待测物定性离子对、碰撞能量 化合物 母离子（m/z）子离子 碰撞能量/eV 275.0 17 大红粉 368.2 219.0 32 注：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱条件优化到最佳 C.2 质谱定性确认 大红粉对照品工作溶液的选择反应监测离子色谱图参见附录D。在相同试验条件下，样品与标准品工作溶液中待测物质的色谱峰相对保留时间的偏差在2.5%以内，并且选择的离子对均出现，同时与标准品的相对丰度允许偏差不超过表C.2规定的范围，则判断样品中存在对应的被测物。表 C.2 使用液相色谱质谱/质谱定性确证时相对离子丰度最大允许偏差 相对丰度（基峰）/%相对离子丰度最大允许误差/%50 20 20 50 25 10 20 30 10 50 （2）非商业性声明：附录 C 中所列参考质谱条件是在 Thermo TSQ Quantum AM 型液质联用仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅提供参考，并不涉及商业目的，鼓励方法使用者尝试不同厂家或型号的仪器。DBS 50/0152013 8 C C 附录附录 D D （资料性附录资料性附录）大红粉的多反应监测大红粉的多反应监测（MRMMRM）离子色谱图离子色谱图 RT:0.08-10.9212345678910Time(min)01020304050607080901000102030405060708090100Relative Abundance5.301.195.571.313.681.153.285.858.634.976.852.807.7210.279.905.301.185.611.294.075.892.996.871.077.65 8.3310.108.99NL:5.17E6m/z=218.99