DBS32 014-2017 食品安全地方标准 食源性致病微生物快速检测.pdf

DBS 江苏省地方标准 DBS 32/0142017 食品安全地方标准 食源性致病微生物快速检测 2017-11-27 发布 2017-11-27 实施 江苏省卫生和计划生育委员会 发 布 DBS 32/0142017 I 前 言 本标准系首次发布。DBS 32/0142017 1 食品安全地方标准 食源性致病微生物快速检测 1 范围 本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、副溶血性弧菌和志贺氏菌的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于肉制品、水产制品、即食蛋制品、粮食制品、即食豆类制品、巧克力类及可可制品、即食果蔬制品、饮料、冷冻饮品、即食调味品、坚果籽实制品等食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、副溶血性弧菌和志贺氏菌的快速检测。2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 实时荧光 PCR 仪。2.2 冷冻离心机：12000 r/min，4 C。2.3 均质器。2.4 恒温空气振荡摇床：36 C 1 C、30 C 1 C、42 C 1 C。2.5 恒温水浴锅：95 C 1 C。2.6 天平：感量 0.01 g。2.7 冰箱：2 C5 C、-20 C。2.8 微量移液器：0.1 L-2.5 L、1 L-10 L、10 L-100 L、100 L-1000 L。2.9 灭菌吸头：10 L、200 L、1000 L。2.10 厌氧培养装置。2.11 灭菌 1.5 mL 离心管。3 试剂与培养基 3.1 PCR 实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格，121 C 高压灭菌 30 min。3.2 Taq DNA 聚合酶：5 U/L。3.3 脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）：10 mmol/L。3.4 DNA 提取试剂：称取 0.1 g chelex 100 粉末，加入灭菌蒸馏水定容至 100 mL，保存于-20 C 备用；或使用商品化的 DNA 提取试剂盒。3.5 10 PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.4），200 mmol/L 氯化钾，15 mmol/L 氯化镁。3.6 引物和探针：引物和探针序列见附录 A，加水稀释至 10 mol/L，其中探针的 5端标记 FAM，3端标记 TAMRA。3.7 培养基 3.7.1 7.5%氯化钠肉汤：见 GB 4789.10。DBS 32/0142017 2 3.7.2 缓冲蛋白胨水（BPW）：见 GB 4789.4。3.7.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见 GB 4789.4。3.7.4 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见 GB 4789.4。3.7.5 李氏增菌肉汤 LB（LB1，LB2）：见 GB 4789.30。3.7.6 改良 EC 肉汤（mEC+n）：见 GB 4789.36。3.7.7 3%氯化钠碱性蛋白胨水：见 GB 4789.7。3.7.8 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见 GB 4789.5。4 操作步骤 4.1 样品制备和增菌培养 4.1.1 金黄色葡萄球菌 样品处理步骤按照GB 4789.10进行，将处理后的7.5%氯化钠肉汤样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，36 C 1 C，200 r/min振摇8 h。4.1.2 沙门氏菌 样品处理步骤按照GB 4789.4进行，将处理后的BPW样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，36 C 1 C、200 r/min 振摇 4 h。从培养后的样品匀液中移取 1 mL，转接种于 10 mL SC 增菌液，置于 36 C 1 C恒温空气振荡摇床，200 r/min 振摇 4 h。另取 1 mL，转接种于 10 mL TTB 增菌液，置于 42 C 1 C 恒温空气振荡摇床，200 r/min 振摇 4 h。4.1.3 单核细胞增生李斯特氏菌 样品处理步骤按照GB 4789.30进行，将处理后的LB1样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，30 C 1 C、200 r/min振摇4 h；移取0.1 mL，转种于10 mL LB2 增菌液内，30 C 1 C，200 r/min振摇4 h。4.1.4 大肠埃希氏菌 O157：H7 样品处理步骤按照GB 4789.36进行，将处理后的改良EC肉汤样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，36 C 1 C，200 r/min振摇8 h。4.1.5 副溶血性弧菌 样品处理步骤按照GB 4789.7进行，将处理后的3%氯化钠碱性蛋白胨水样品匀液放置于恒温空气振荡摇床中，36 C 1 C，200 r/min振摇8 h。4.1.6 志贺氏菌 样品处理步骤按照GB 4789.5进行，将处理后的志贺氏菌增菌肉汤样品匀液放置于厌氧培养装置中，41.5 C 1 C厌氧培养8 h。4.2 致病菌 DNA 提取 分别取4.1培养后的增菌液1 mL，加入1.5 mL无菌离心管中，8000 r/min离心5 min，吸弃上清；加入50 L DNA提取试剂（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后置于95 C 1 C水浴5 min，12000 r/min，4 C离心5 min，取上清，-20 C保存，作为模板DNA备用。注：也可使用商品化的细菌DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作提取致病菌DNA。DBS 32/0142017 3 4.3 实时荧光 PCR 检测 4.3.1 配置 PCR 反应体系（25 L）：10 PCR 缓冲液 2.5 L，引物各 0.5 L，探针 1 L，dNTP 1 L，Taq DNA 聚合酶 0.5 L，无菌水 17 L，模板 DNA 2 L。4.3.2 反应条件：95 C 预变性 30 s；94 C 变性 5 s，60 C 退火延伸 40 s，进行 40 个循环。注：PCR反应参数可根据PCR仪型号的不同进行适当的调整。4.3.3 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为阳性标准菌株 DNA，阴性对照为用无菌水代替样品进行增菌得到的 DNA 提取液，空白对照为无菌水。4.4 实验结果与判定 阳性对照应出现典型扩增曲线，Ct值35而40，为可疑结果。阳性结果与可疑结果须按照相应GB 4789标准进行检验，根据国家标准方法得出的结果判定。4.5 检测过程中防止交叉污染及生物安全要求 检测过程中防止交叉污染按照GB/T 27403中的规定执行，实验室生物安全要求应符合GB 19489的规定。DBS 32/0142017 4 A A 附 录 A（规范性附录）致病菌实时 PCR 检测所用引物和探针序列 A.1 致病菌实时荧光PCR法中所用的引物探针序列见表A.1。表A.1 致病菌实时 PCR 检测所用引物和探针序列 致病菌名称 引物序列 探针序列 靶基因名称及 GenBank 编码 副溶血性弧菌 5-GCG ACC TTT CTC TGA AAT ATT AAT TGT-3 5-CGC ACA AGG CTC GAC GGC TGA-3 VP0819(NC_004603.1)5-CAT TCG CGT GGC AAA CAT C-3 金黄色葡萄球菌 5-AAA TTA CAT AAA GAA CCT GCG ACA-3 5-AAT TTA ACC GTA TCA CCA TCA ATC GCT TT-3 SAOUHSC_00818(NC_007795.1)5-GAA TGT CAT TGG TTG ACC TTT GTA-3 单核细胞增生李斯特氏菌 5-CTG AAT CTC AAG CAA AAC CTG GT-3 5-ATA CGA TAA CAT CCA CGG CTC TGG CTG G-3 iap(NC_003210.1)5-CGC GAC CGA AGC CAA CTA-3 沙门氏菌 5-CCA GTT TAT CGT TAT TAC CAA AGG-3 5-CTC TGG ATG GTA TGC CCG GTA AAC A-3 invA(NC_003197.2)5-ATC GCA CCG TCA AAG GTC-3 大肠埃希氏菌 O157：H7 5-TTT CAT ACT TAT TGG ATG GTC TCA A-3 5-AGG ACC GCA GAG GAA AGA GAG GAA TTA AGG-3 ECs2841(NC_002695.1)5-CGA TGA GTT TAT CTG CAA GGT GAT-3 志贺氏菌 5-CGC AAT ACC TCC GGA TTC C-3 5-AAC AGG TCG CTG CAT GGC TGG AA-3 ipaH4.5(NC_007607.1)5-TCC GCA GAG GCA CTG AGT T-3 _