TCALAS 89-2020 实验动物 鼠痘病毒环介导等温扩增 （LAMP）检测方法.pdf

ICS 65.020.30 B 44 中 国 实 验 动 物 学 会 团 体 标 准 T/CALAS 892020 实验动物 鼠痘病毒环介导等温扩增（LAMP）检测方法 Laboratory animal-Detection of ectromelia virus by loop-mediated isothermal amplification assay 2021-01-01 2020-12-01 发布实施 中国实验动物学会 发布 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 给出的规则起草。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：上海实验动物研究中心、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本文件主要起草人：周洁、于海波、李昌文、陶凌云、陈洪岩。全国团体标准信息平台 实验动物 鼠痘病毒环介导等温扩增（LAMP）检测方法 1 范围 本文件规定了实验动物鼠痘病毒（ectromelia virus，Ect）LAMP 检测的原理、方法和结果判定。本文件适用于实验小鼠鼠痘病毒的检测。2 规范性引用文件 本文件无规范性引用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 环介导等温扩增法 loop-mediated isothermal amplification，LAMP 环介导等温扩增法是利用 46 条特异性引物在具有链置换活性的 Bst DNA 聚合酶的作用下，恒温条件下 1 h 内完成核酸扩增反应的一种特异、高效、可视化的链取代核酸扩增技术。4 基本原理 DNA 在 65左右处于动态平衡状态，利用可以产生环状结构的引物和 Bst DNA 聚合酶链置换合成的活性，在靶序列两端引物结合处循环不断地产生环状单链结构。任何一个引物向双链 DNA 的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离变成单链，引物在恒温条件下引发新链的合成，达到高效扩增靶基因的目的。最后通过核酸扩增过程中产生焦磷酸镁沉淀与荧光染料结合产生的绿色荧光判定阳性结果。5 主要试剂和器材 5.1 试剂 a）病毒基因组 DNA 提取试剂盒。b）核糖核酸环介导等温扩增试剂盒。c）环介导等温扩增荧光目视检测试剂盒。5.2 器材 a）水浴锅。全国团体标准信息平台 111 实验动物 鼠痘病毒环介导等温扩增（LAMP）检测方法b）环介导等温扩增反应管。c）生物安全柜。d）组织匀浆机。6 检测方法 6.1 空白对照 去离子水。6.2 阴性对照 不含鼠痘病毒的样本 DNA。6.3 阳性对照 鼠疫病毒 DNA。6.4 引物 F3：5-CTAATACAAAATGTGACAAGTGC-3 B3：5-CTGCAACCGTTTGATCCT-3 FIP：5-TTGCCTCGACAACTTAGACACGCCAGATGACACCTTTACATCC-3 BIP：5-ATCGTGTAGTAACACACAGGACATCAAATTCGCAGTAGTATCCG-3 LP：5-TGGCTACTCATCTAAAGGAGATGT-3 6.5 样品的制备 活体小鼠眼球采集全血 300 L，或剖检采集肝、脾组织 1.0 g。脏器组织置于 2 mL 离心管，加入适量 0.1 mol/L pH 7.27.6 的磷酸盐缓冲液（PBS），充分匀浆后 12 000 r/min 离心 5 min，取上清，用病毒基因组 DNA 提取试剂盒提取病毒 DNA，具体步骤参照产品说明书。全血无需处理直接提取病毒 DNA。测定 DNA 浓度进入下一步骤，或20保存备用。6.6 核酸扩增 在反应管中配置 25 L 反应体系见表 1。表 1 鼠痘病毒 LAMP 反应体系 反应组分 反应量 2反应缓冲液（RM）12.5 L FIP 引物 40 pmol（1 L）BIP 引物 40 pmol（1 L）F3 引物 5 pmol（1 L）B3 引物 5 pmol（1 L）Bst DNA 聚合酶 1 L 去离子水 1.5 L 样本 DNA 5 L 荧光染料 FDR 1 L 63恒温下反应 60 min。全国团体标准信息平台 第三篇 实验动物检测方法系列标准 112 注：本节给出聚合酶相关信息是为了方便本文件使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，那么可使用这些等效产品。7 结果判定 反应结束后观察反应液颜色，呈现绿色荧光判为阳性，呈现浅橙色透明判为阴性。8 结果解释 环介导等温扩增敏感度极高，可检出几个拷贝的核酸；通过 4 条引物同时锁定 6 个特异性位点，可保证检测结果准确；最低检出值的反应液绿色荧光清晰可见。因此，本试验只判定阴性、阳性，不设疑似阳性或弱阳性。9 结果报告 根据判定结果，做出检测报告。参 考 文 献 周洁,陶凌云,赵丽娟,等.2018.鼠痘病毒环介导等温扩增可视化检测方法的建立J.实验动物与比较医学,38(2):160-164.全国团体标准信息平台