TCALAS 107-2021 实验动物 钩端螺旋体检测方法.pdf

ICS 65.020.30 B 44 中 国 实 验 动 物 学 会 团 体 标 准 实验动物 钩端螺旋体PCRT/CALAS 107-2021检测方法 Laboratory animalPCR method for Leptospira testing 2022-01-10 发布 中国实验动物学会 2022-01-10 实施 发布 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国实验动物学会归口。本文件由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、公安部南昌警犬基地。本文件主要起草人：韩凌霞、刘占斌、叶俊华。全国团体标准信息平台 实验动物 钩端螺旋体 PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了部分实验动物的钩端螺旋体PCR检测方法中的样品采集与储存、样品处理、基因组DNA提取、PCR反应和结果判定。本文件适用于部分实验动物的钩端螺旋体核酸检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 35823 实验动物 动物实验通用要求 GB/T 35892 实验动物 福利伦理审查指南 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 1673 畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程 生物安全法 中华人民共和国主席令（第五十六号令）3 术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。3.1 钩端螺旋体 Leptospira 钩端螺旋体，简称钩体，呈螺旋状，一端或两端弯曲呈钩状或问号状，长 20，旋转式运动活泼，具有较强的组织穿透力。根据抗原结构成分和交叉凝集试验可分为多个血清型和血清群，引起家畜发病的有波摩那型、犬型、秋季热型、出血黄疸型、澳洲型、流感伤寒型等。可感染几乎所有温血动物，鼠类是最重要的储存宿主，引起发热、黄疸、血红蛋白尿、出血性素质、流产、皮肤和黏膜坏死以及水肿等。3.2 16S rDNA 等 原核核糖体16S亚基基因，是所有原核生物基因组中编码核糖体RNA（rRNA）的序列，具有高度的种属特异性，常被用来作为原核生物分类的依据。全国团体标准信息平台 中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）80 4 样品采集前的准备 4.1 风险评估与控制 按照生物安全法和GB 19489的规定对被检实验动物的检测风险进行评估与控制。4.2 生物安全 动物采样时的实验室管理、实验条件、实验动物质量、基本技术操作应符合GB/T 35823的规定。4.3 动物福利伦理 动物采样时的福利与伦理，应符合GB/T 35892的规定。5 样品的采集与储存 5.1 血液 a）疑似动物感染钩端螺旋体后一周内或正处发热期，可采集抗凝血。b）犬和猪宜通过前臂头静脉或颈静脉采集，动物的保定和采集步骤按照NY/T 541执行。c）小鼠可通过尾静脉或颌下静脉采集，采血过程符合GB/T 35892的规定。d）采用肝素钠抗凝管收集血液时，至少应采集0.25 mL血液；采用5%柠檬酸钠溶液抗凝时，血液量应比抗凝剂多4倍，总体积至少1 mL。5.2 尿液 a）出现黄疸、发热体温升高后恢复正常、呕吐等疑似感染钩端螺旋体的动物，或者无症状但需要检测时，可采集尿液。尿液的体积以0.5 mL5 mL为宜。b）采取膀胱穿刺法对犬和猪取尿时，将动物取仰卧位保定，手触摸确定膀胱位置，依据NY/T 541的规定进行表皮消毒，将一次性注射器针头垂直刺入皮肤进入膀胱，抽取尿液。有条件的可以在超声引导下膀胱穿刺取尿。已剖检的动物可直接用注射器刺入膀胱取尿。c）利用导尿管收集尿液时，犬和猪可侧卧或仰卧位保定，依据NY/T 541的规定对尿道口常规消毒，选取大小合适的导尿管从尿道口缓慢插入膀胱，待尿自动流出接取，或将导尿管连接注射器抽取。d）直接接取尿液时，可将适当大小的无菌离心管或容器，用绳固定在阴茎下或外阴部，接取尿液。按照NY/T 541的操作执行。e）抓取小鼠时，若动物受应激排尿，尿液粘在被毛上，也可用移液器直接吸取。5.3 脑脊液 对小鼠可采集脑脊液，参照NY/T 541的规定执行。全国团体标准信息平台 81 实验动物 钩端螺旋体 PCR 检测方法 5.4 肾脏组织 死亡2 h以内的动物，从背侧或腹侧打开死亡动物腹腔，完整取下肾，用密封袋移至实验室备用。5.5 样品的储存 a）所有采集的样品，宜在2 h内提取核苷酸，否则应置于80保存。b）详细记录材料名称、来源、采集时间、地点、采集人和保存条件。6 样品的处理 6.1 抗凝血 抗凝血800g 离心10 min，取血浆4下13 000g 离心10 min，弃上清。沉淀用100 L灭菌水再悬浮，96加热10 min后备用。6.2 尿液 尿液经800g 离心10 min，除去膀胱上皮细胞和尿结晶等大颗粒。上清液4下13 000g 离心10 min，弃上清。沉淀用100 L灭菌水再悬浮，96加热10 min后备用。6.3 脑脊液 脑脊液800g 离心10 min，取上清液4下13 000g 离心10 min，弃上清。沉淀用100 L灭菌水再悬浮，96加热10 min后备用。6.4 肾组织 剪取肾组织约100 mg，加1 mL磷酸盐缓冲液（PBS），研磨成组织匀浆。将匀浆液800g 离心10 min，去除大的组织块，上清液4下13 000g 离心10 min，弃上清。沉淀用100 L灭菌水再悬浮，96加热10 min后备用。7 基因组 DNA 的提取 按照NY/T 1673中的苯酚氯仿法，或商品化试剂盒的产品说明书提取样品DNA，紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度，浓度50 ng/L，纯度OD260/OD280=1.61.8时可用于检测。8 PCR 反应 8.1 引物序列 F：5-GGCGGCGCGTCTTAAACATG-3 R：5-TTCCCCCCATTGAGCAAGATT-3 全国团体标准信息平台 中国实验动物学会团体标准汇编及实施指南（第六卷）82 扩增产物的长度应为331 bp。8.2 反应体系 DNA模板1.5 L，引物F（10 mol/L）1 L，引物R（10 mol/L）1 L，Taq mix 酶12.5 L，ddH2O 9 L，总体积25 L。8.3 反应条件 94 3 min；63 1.5 min，72 2 min；94 1 min，63 1.5 min，72 2 min，共29个循环；72延伸10 min。设用无菌水作为模板的空白对照。8.4 产物检测 a）反应结束后，取10 L PCR产物与上样缓冲液混合，于1%琼脂糖凝胶中电泳。每个样品加样量为10 L，同时以DNA分子质量标准物为参照。150 V恒压电泳25 min，成像观察结果。b）将全部PCR产物直接进行核苷酸测序，测序引物可使用F或R。测序结果通过美国国家生物信息学数据库（NCBI）GenBank BLAST序列比对，与登录号为CP020414.2（核苷酸序列见附录A）或其他收录有钩端螺旋体16S rDNA的数据库进行序列同源性比对。9 结果判定 9.1 电泳结果判定 a）空白对照没有扩增出条带，结果可继续判定。b）被检样品仅在约331 bp处出现唯一清晰条带，结果判为阳性。c）被检样品未出现条带，或条带的分子质量明显不符合331 bp，结果判为阴性。9.2 序列结果判定 测定的核苷酸序列与数据库提供的钩端螺旋体16S rDNA 序列（参见附录A）的同源性为100%，判定结果为阳性。全国团体标准信息平台 83 实验动物 钩端螺旋体 PCR 检测方法 附 录 A（资料性附录）钩端螺旋体 16S rDNA 序列 A.1 钩端螺旋体 16S rDNA 的序列 钩端螺旋体16S rDNA长331 bp，基因组序列如下，其中首尾端的斜体部分为PCR扩增用引物同源序列。5-TTCCCCCCATTGAGCAAGATTCTTAACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGACCGTGTCTCAGTTCCATTGTGGCCGAACACCCTCTCAGGCCGGCTACCGATCGTCGCCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTAGCTAATCGGACGCGGGCTCATCTCCGAGCAATAAATCTTTACCCGAAAAATCTTGTGATCTCTCGGGACCATCCAGTATTAGCTTCCCTTTCGGAAAGTTATCCCAGACTCAGAGGAAGATTACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCGCTGAGTATTGCTACTCCGCTTGACTTGCATGTTTAAGACGCGCCGCC-3。A.2 与哥本哈根型标准株 FDAARGOS_203 的序列比对结果 全国团体标准信息平台