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DBS13
001-2015
食品安全地方标准
食品中诺如病毒检测
001
2015
食品安全
地方
标准
食品
中诺如
病毒
检测
2015-04-23 发布2015-05-01 实施DBS13河北省地方标准DBS13/0012015食品安全地方标准食品中诺如病毒检测河北省卫生和计划生育委员会河北省卫生和计划生育委员会发布发布DBS13/0012015I前言本标准按GB/T1.1-2009规定的格式编写。本标准的附录A为规范性附录。本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。本标准于2015年4月23日首次发布。DBS13/00120151食品安全地方标准食品中诺如病毒检测1范围本标准规定了贝类、生食叶类蔬菜和包装饮用水等食品中诺如病毒普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于贝类、生食叶类蔬菜和包装饮用水等食品中型和型诺如病毒的检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。诺如病毒norovirus诺如病毒属于人类杯状病毒科,诺如病毒属,是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径约为 26nm35nm,无包膜,表面粗糙,球形,呈二十面体对称。诺如病毒基因组是单股正链 RNA,组成长约 7kb7.5kb,电镜下缺乏显著的形态学特征,负染色电镜照片显示,诺如病毒是具有典型的羽状边缘、表面有凹痕的小圆状结构病毒。诺如病毒共可分为 个基因型,其中感染人的主要是型和型。3设备和材料3.1电子天平:感量 0.1g。3.2组织匀浆器或其他可以破碎样品的工具。3.3普通冰箱:28。3.4超低温冰箱:-805。3.5高速冷冻离心机:最大离心力大于 15000g。3.6恒温水浴箱或金属浴:3765。3.7PCR 扩增仪。3.8实时荧光 PCR 扩增仪。3.9电泳仪。3.10凝胶成像系统。3.11震荡混匀器。3.12电热干燥箱。DBS13/001201523.13pH 计。3.14水过滤系统。3.15微量可调移液器:1L10L、10L100L、100L1000L。3.16洗耳球或电动移液器。3.17无 RNA 酶的玻璃容器、微量加样器吸头、无菌 50mL 离心管、无菌 1.5mL 离心管和 PCR 管。3.18无 RNA 酶的一次性移液管:10mL、25mL。3.19混合硝酸纤维素膜:孔径 0.22m。4试剂除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯。4.1无 RNA 酶的超纯水:见附录 A.1。4.2甘氨酸缓冲液:见附录 A.2。4.35X PEG8000 溶液:见附录 A.3。4.42.5mol/L 氯化镁(MgCl2)溶液:见附录 A.4。4.5牛肉膏-甘氨酸洗脱液:见附录 A.5。4.6氯仿。4.71mol/L 盐酸溶液。4.81mol/L 氢氧化钠溶液。4.9病毒 RNA 提取试剂盒。4.10Taq DNA 聚合酶:-20保存,避免反复冻融。4.11逆转录酶:-20保存,避免反复冻融。4.12RNA 酶抑制剂:-20保存,避免反复冻融。4.13dNTPs:含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10mmol/L。4.14引物和探针:使用浓度为 25mol/L,-20保存,引物和探针序列见表 1 和表 2。表 1普通 RT-PCR 检测引物检测的病毒类群引物序列片段大小/bpGI 和 GII正向引物 F:5-ATACCACTATGATGCAGATTA-3326反向引物 R:5-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3DBS13/00120153表 2实时荧光 RT-PCR 检测引物和探针检测的病毒类群引物和探针序列片段大小/bpGI正向引物 F:5-CGCTGGATGCGNTTCCAT-3反向引物 R:5-CCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3探针:5-FAM-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-TAMRA-386GII正向引物 F:5-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3反向引物 R:5-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3探针:5-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-TAMRA-3894.151TAE:见附录 A.6。4.16分子量标记:100bp1000bp。4.17诺如病毒阳性对照。4.18诺如病毒阴性对照。4.19溴化乙锭(EB)溶液(10g/L):见附录 A.7。4.2010上样缓冲液:见附录 A.8。4.21含 0.5g/mL 溴化乙锭(或 5%GoldView)的 1.5%琼脂糖凝胶:见附录 A.9。5检测程序诺如病毒检测程序见图。DBS13/00120154图1诺如病毒检测程序6检测步骤6.1样品的运输与保存运输过程中保持样品温度在 05。实验室接到样品后应尽快进行检测。如果暂时不能检测应将样品保存于-80冰箱中,避免样品反复冻融。6.2样品处理和病毒富集6.2.1贝类6.2.1.1取样:首先用灭菌蒸馏水将贝壳表面的污泥清洗干净,打开贝壳后,倒掉腔内的液体,使用无菌的剪刀和镊子取贝类消化腺组织。6.2.1.2按无菌操作取 5g 消化腺组织,在组织匀浆器中高速匀浆 3min 或切碎成 2mm3以下的小块,放入 50mL 离心管中,加入 35mL 甘氨酸缓冲液(样品重量与缓冲液体积之比为 1:7),37孵育 30minDBS13/00120155或室温下剧烈振荡 10min。4,10000g 离心 30min。6.2.1.3转移上清液至另一个 50mL 离心管中,加入 10mL 或更多氯仿,充分振荡,放置 10min,4,10000g 离心 30min。如上清较浑浊,可重复用氯仿再抽提一次。6.2.1.4转移上清至另一个 50mL 离心管中,用 1mol/L 盐酸调节 pH 至 7.00.5,加入 0.25 倍体积的 PEG8000 溶液(PEG 终浓度为 8%),上下颠倒离心管以充分混匀。6.2.1.5冰上放置至少 1h 或 4放置过夜。4,10000g 离心 5min。弃去上清,保留沉淀。6.2.1.6加入 200L 无 RNA 酶的超纯水,60加热 5min 充分溶解沉淀。4,10000g 离心 3min,取上清,得到病毒粗提产物。6.2.2生食叶类蔬菜6.2.2.1使用无菌的剪刀和镊子将 25g 生食叶类蔬菜剪成约 2.5cm2.5cm2.5cm 的小块,装入 50mL离心管中,加入 40mL 甘氨酸缓冲液,37孵育 30min 或室温下剧烈震荡 10min,4,10000g 离心 30min。6.2.2.2转移上清至另一个 50mL 离心管中,用 1mol/L 盐酸溶液调节 pH 至 7.00.5,加入 0.25 倍体积的 PEG8000 溶液,上下颠倒离心管以充分混匀。6.2.2.3冰上放置至少 1h 或 4放置过夜。4,10000g 离心 5 min。弃去上清,保留沉淀。6.2.2.4加入 200L 无 RNA 酶的超纯水,60加热 5min 充分溶解沉淀。4,10000g 离心 3min,取上清,得到病毒粗提产物。6.2.3包装饮用水6.2.3.1500mL 水样中加入 10mL 的 2.5mol/L 氯化镁溶液,使其终浓度达到 0.05mol/L;用 1mol/L盐酸调节水样 pH 至 3.00.5。6.2.3.2采用真空抽滤使之通过孔径为 0.22m 的混合硝酸纤维素膜(混浊度较大的污水,需预先澄清),然后用 10mL 牛肉膏-甘氨酸洗脱液(pH9.5)震荡洗脱滤膜 2030min。6.2.3.3去除滤膜,用 1mol/L 盐酸溶液调节洗脱液 pH 至 7.00.5,向洗脱液中加入 0.25 倍体积的PEG8000 溶液,上下颠倒离心管以充分混匀。6.2.3.4将离心管及样液一起放在冰上放置至少 1h 或 4放置过夜。4,10000g 离心 5min。弃去上清,保留沉淀。6.2.3.5加入 200L 无 RNA 酶的超纯水,60加热 5min 充分溶解沉淀。4,10000g 离心 3min,取上清,得到病毒粗提产物。6.3病毒 RNA 的提取和纯化使用病毒 RNA 提取试剂盒进行 RNA 的提取和纯化,采用如下方法,或根据仪器和试剂盒要求调整操作步骤。6.3.1在核酸提取板每孔中加入 20L 磁珠混合物,加入 200L 病毒粗提产物,加入 500L 含有Carrier RNA 的裂解/结合混合液,混匀后震荡 5min 使裂解完全。6.3.2提取板放置磁性抽提架上至少 3min 以捕获磁珠(捕获的时间取决于磁架的类别和型号)。当捕获完全,磁珠会在磁架上形成颗粒。DBS13/001201566.3.3弃去上清,加入 300L 漂洗液 1,震荡 1min,在磁架上放置 1min,弃去上清。6.3.4重复上一步骤一次。6.3.5加入 450L 漂洗液 2,震荡 1min,在磁架上放置 1min,弃去上清。6.3.6重复上一步骤一次。6.3.7离心 2min,去除漂洗液和酒精。6.3.8加入 60L 室温或预热至 6065的洗脱液,震荡 3min,放置磁架上 1min,转移上清至另一个 1.5mL 离心管中,-20保存纯化的 RNA。注意事项:为防止 RNA 降解,所用实验用具及溶液应无 RNA 酶,操作过程中应自始至终佩戴一次性橡胶或乳胶手套,并经常更换。提取后的 RNA 应迅速冷藏或冷冻保存,4保存不超过 8h,-20保存不超过 6 个月,如需长期保存,应放在-805。6.4病毒核酸检测两种方法可任选一种。6.4.1普通 RT-PCR 法6.4.1.1普通 RT-PCR 反应体系一步法普通 RT-PCR 反应体系见表 3。每个反应体系设置两个平行反应。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。以诺如病毒 RNA 为阳性对照,以不含有诺如病毒 RNA 作为阴性对照,以水代替模板作为空白对照。表 3普通 RT-PCR 反应体系名称储液浓度终浓度加样量/L(25L 体系)RT-PCR 缓冲液515.0dNTPs10mmol/L0.2mmol/L0.5正向引物25mol/L1mol/L1.0反向引物25mol/L1mol/L1.0逆转录酶5U/L0.1U/L0.5DNA 聚合酶5U/L0.1U/L0.5模板5.0水(无 RNA 酶)11.56.4.1.2普通 RT-PCR 反应条件反应条件为:反转录42,60min;热失活94,10min;扩增94,1min37,90s40 个循环72,1min延伸74,7min。DBS13/00120157或根据试剂要求调整反应条件。6.4.1.3PCR 扩增产物的电泳检测用电泳缓冲液(1TAE)、0.5g/mL 溴化乙锭(或 GoldView 等核酸染料)配制 1.5%的琼脂糖凝胶(见附录 A.9)。在电泳槽中加入电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝胶。将 9LPCR 扩增产物,加 1L10上样缓冲液,点样,电泳。电压根据电泳槽长度来确定,一般控制在 3V/cm5V/cm,当溴酚蓝移动到凝胶边缘时关闭电源。凝胶成像系统观察电泳结果,获取并保存图像。6.4.2实时荧光 RT-PCR 法6.4.2.1实时荧光 RT-PCR 反应体系一步法 RT-PCR 反应体系见表 4。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。以诺如病毒 RNA 为阳性对照,以不含有诺如病毒 RNA 作为阴性对照,以水代替模板作为空白对照。表 4实时荧光 RT-PCR 反应体系名称储液浓度终浓度加样量/L(50L 体系)RT-PCR 缓冲液5110.0探针25mol/L0.25mol/L0.5正向引物25mol/L0.5mol/L1.0反向引物25mol/L1mol/L2.0RNA 酶抑制剂20U/L10U0.5模板10.0水(无 RNA 酶)26.06.4.2.2实时荧光 RT-PCR 反应条件反应条件为:反转录55,60min;热失活95,5min;扩增95,15s60,1min45 个循环65,1min(检测荧光)或根据试剂要求调整反应条件。7结果判定标准7.1普通 RT-PCR 法如果阴性对照和空白对照均未出现条带,阳性对照出现一条 326bp 大小的条带,而样品未出现预期大小的条带