DB63T 1692-2018 八眉猪细管冻精生产技术规程.pdf

ICS 65.020.30 B 43 备案号：60856-2018 DB63 青海省地方标准 DB 63/T 16922018 八眉猪细管冻精生产技术规程 2018-09-25 发布 2018-12-01 实施 青海省质量技术监督局 发 布 DB 63/T 16922018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由青海省农牧厅提出并归口。本标准起草单位：青海省家畜改良中心。本标准主要起草人：马元梅、张楠、冯宇诚、张晋青、常永梅、赵春川、王芳、郭占泽、赵青山、许发芳、莫常山、王朝风、何得仓、李景、刘于刚。DB 63/T 16922018 1 八眉猪细管冻精生产技术规程 1 范围 本规程规定了种公猪的选择和调教、采精前准备、采精、精液处理、精液冷冻、细管冻精解冻和镜检、包装、标记和贮存、细管冻精质量评价等内容。本规程适用于八眉猪细管冻精的生产。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4143 牛冷冻精液 GB/T 5458 液氮生物容器 NY/T 2823 八眉猪 3 种公猪的选择和调教 3.1 种公猪的选择 种公猪应符合NY/T 2823要求，三代系谱清楚。3.2 种公猪的饲养管理 种公猪单圈饲养。定时定量饲喂，以精料为主，满足其营养需要，消化能需要量为28.45 MJ，体重90 kg以下的公猪粗蛋白需要量为14%，90 kg以上为12%，每千克饲料含维生素A 3531 IU，维生素E 11 IU。供给充足清洁饮水。经常刷拭猪体，保持清洁。每天适度运动1 h2 h。3.3 种公猪的调教 选择发情旺盛的母猪并固定，引诱公猪爬跨，待其爬上母猪后，将公猪阴茎导入空拳内进行采精，反复训练2 次3 次。4 采精前准备 4.1 器械 4.1.1 仪器设备 37 恒温箱、17 车载恒温箱、水浴锅、移液枪、密度仪、显微镜、离心机、冰箱、低温柜、细管封装一体机、程控冷冻仪、液氮生物容器、干燥箱。4.1.2 器具 DB 63/T 16922018 2 保温集精杯、过滤膜、比色皿、锥形瓶、载玻片、盖玻片、离心管、烧杯、量筒、0.25 ml细管、提筒、试管、细管剪。4.2 器械的清洗 4.2.1 仪器设备的清洗和消毒 各仪器设备应定期用紫外灯照射消毒。使用结束后，应用洁净、柔软的布将残留的精液、水、污物擦拭干净。4.2.2 器具的清洗和消毒 各器具使用后浸泡在自来水中。洗涤时，先在加有洗涤剂的温热水中刷拭，然后用清水反复冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗。载玻片和盖玻片洗净后用柔软的布擦干备用，其他玻璃器皿将水晾干后放入干燥箱，加热至160 恒温60 min，自然冷却后待用。0.25 ml细管应置于紫外灯下消毒，其他非玻璃材质的器具洗净后自然晾干，用75%酒精棉球擦拭消毒。4.3 采精场所的卫生和消毒 采精场所保持安静，地面保持清洁卫生，采精前应喷洒0.1%高锰酸钾进行消毒。4.4 稀释液配制 4.4.1 常温保存稀释液配制 向锥形瓶中加入1000 ml双蒸水，分别称取葡萄糖37 g、乙二胺四乙酸1.25 g、二水柠檬酸钠0.6 g、碳酸氢钠1.25 g、氯化钾0.075 g，溶解于双蒸水中，搅拌均匀，用定性滤纸过滤至另一锥形瓶中，滤液煮沸15 min，待温度降至常温，称取青霉素钠0.6 g、硫酸链霉素1 g加入滤液中并混匀。4.4.2 冷冻基础液配制 向锥形瓶中加入1000 ml双蒸水，分别称取葡萄糖11 g、柠檬酸14.8 g、三羟甲基氨基甲烷24.2 g，溶解于双蒸水中，搅拌均匀，用定性滤纸过滤至另一锥形瓶中，滤液煮沸15 min，待温度降至常温，称取青霉素钠0.6 g、硫酸链霉素1 g加入滤液中并混匀。4.4.3 冷冻稀释液 I 液配制 向锥形瓶中加入800 ml冷冻基础液、200 ml新鲜卵黄，搅拌均匀，置于17 备用。4.4.4 冷冻稀释液 II 液配制 向锥形瓶中加入940 ml冷冻稀释液I液、60 ml甘油，搅拌均匀，置于5 备用。4.4.5 解冻液配制 向锥形瓶中加入1000 ml双蒸水，分别称取葡萄糖50 g、二水柠檬酸钠3 g、乙二胺四乙酸1 g，溶解于双蒸水中，搅拌均匀，用定性滤纸过滤至另一锥形瓶中，滤液煮沸15 min，待温度降至常温。5 采精 5.1 台猪和种公猪的准备 DB 63/T 16922018 3 选择健壮、大小适中、性情温顺的母猪做台猪。采精前用清水冲洗台猪的外阴、臀部和公猪阴茎、包皮及其周围腹壁，然后用0.01%高锰酸钾溶液对公猪被清洗过的部位消毒，再用温水冲洗干净。5.2 采精频率 后备种公猪每周采精一次，成年种公猪每周可采精两次。5.3 采精方法 从37 恒温箱中取出保温集精杯，杯口覆盖过滤膜。采精员戴乳胶手套，蹲在台猪的一侧，诱导公猪爬跨台猪，按摩公猪睾丸，待公猪阴茎伸出后导入空拳内并握紧，当阴茎充分勃起后顺势向前牵拉，手指有弹性并具有节奏的松握，引起公猪射精。另一手持保温集精杯采集中段精液，弃去前、后段精液。取下过滤膜，盖保温盖。6 精液处理 6.1 准备 凡接触精液的器皿均放在37 恒温箱内，装有常温保存稀释液的锥形瓶置于37 水浴锅待常温保存稀释液温度升至37。6.2 原精质量要求 6.2.1 原精外观要求 精液为乳白色，无皮毛等异物，略带腥味。6.2.2 体积 将精液倒入量杯内直读精液体积。精液体积100 ml。6.2.3 密度测定 用移液枪吸取3960 l生理盐水于比色皿中，再吸取40 l精液，同生理盐水混合均匀，用密度测定仪测定精子密度。每毫升精液精子密度1 108 个。6.2.4 精子活力和畸形率 取一小滴精液于载玻片，加盖盖玻片在带有38 恒温装置的显微镜下检查精子活力和畸形率。精子活力60%，精子畸形率15%。6.3 精液常温稀释 用37 常温保存稀释液按11的比例等温稀释精液，将混合液放入17 恒温箱待其温度降至17，并于72 h内完成冻精。6.4 精液离心和上清液体积测定 将常温稀释后的混合液倒入50 ml离心管中，在17、重力800 g的条件下离心12 min，吸取上清液于量筒，直读体积。6.5 冷冻稀释液添加量计算 DB 63/T 16922018 4 6.5.1 最终精子总数计算 离心后精子总数按式（1）计算：1vn.(1)式中：n最终精子总数，单位为个；每毫升精液精子密度，单位为个；v1精液体积，单位为毫升（ml）。6.5.2 精子体积计算 离心后沉淀精子体积按式（2）计算：21vvv.(2)式中：v精子体积，单位为毫升（ml）；v1精液体积，单位为毫升（ml）；v2上清液体积，单位为毫升（ml）。6.5.3 最终精液总量计算 保证最终每毫升精液中精子密度3108个，最终稀释后精液总量按式（3）计算：3 ns.(3)式中：s最终精液总量，单位为毫升（ml）；n最终精子总数，单位为个。6.5.4 冷冻稀释液添加量计算 冷冻稀释液I液和II液添加量按式（4）计算：221vsaa.(4)式中：a1冷冻稀释液I液添加量，单位为毫升（ml）；a2冷冻稀释液II液添加量，单位为毫升（ml）；s最终精液总量，单位为毫升（ml）；v精子体积，单位为毫升（ml）。6.5.5 精液低温稀释 用17 的冷冻稀释液I液等温稀释6.3中温度降至17 的混合液；将装有稀释后精液的锥形瓶置于装有17 水的烧杯中，放入5 冰箱平衡2 h。用5 的冷冻稀释液II液等温稀释,经平衡、温度降至5 的精液。冷冻稀释液I液和II液添加量按照6.5.4计算。7 精液冷冻 DB 63/T 16922018 5 7.1 细管封装 7.1.1 细管要求 细管为无毒、耐低温的专用塑料管，0.25 ml剂型，保证清洁、无菌。7.1.2 封装 在4 低温柜中采用细管封装一体机通过计算机程序控制，进行灌装、封口、打印标识。7.1.3 细管标识 细管标识清晰，信息齐全，包括冻精产地、品种、冻精生产日期、猪号。7.2 上架 封装后的细管整齐的码放在专用细管架上。7.3 冷冻 采用程控冷冻仪冷冻，按照预先设定的最佳冷冻曲线自动完成冷冻。最佳冷冻曲线降温速率为：4 1（降温速率2/min），共1 min 30 s；1 -25（降温速率30/min），共2 min 24 s；-25 -140（降温速率30/min），共6 min 12 s；-140 保持30 s。7.4 细管冻精收集 冷冻完成后，按猪号取出细管冻精投入盛满液氮的提筒中，细管的超声波封口端在上，棉塞端在下，并迅速浸入液氮中。8 细管冻精解冻和镜检 8.1 细管冻精解冻 预先将水浴锅温度调至38，将解冻液加入试管，并浸泡在38 水浴锅中预热。用长柄镊子取一支细管冻精迅速浸入38 水浴锅中晃动，待溶解后立即取出，用吸水纸或纱布擦干水珠，再用细管剪剪去超声波封口端，用推针将精液注入预先升温至38 的试管中，用38 解冻液按精液与解冻液1：3的比例进行稀释。8.2 活力检测 方法见本标准的6.2.4。活力30%的细管冻精作为初检合格品妥善贮存。9 包装、标记和贮存 9.1 包装 用无菌纱布袋包装，包装应在-140 以下环境中进行。9.2 标记 包装袋外应进行明显标记。注明公猪号、生产日期、数量、精子活力。DB 63/T 16922018 6 9.3 贮存 用液氮生物容器贮存细管冻精，液氮生物容器符合GB/T 5458要求。设专人保管，每周定时加一次液氮，液氮应浸没冻精。应经常检查液氮生物容器的状况，如发现容器外壳结白霜，立即将细管冻精转移到其他液氮生物容器内保存。取放细管冻精时，提筒在容器颈下，冻精离开液氮的时间不得超过5 s。取放之后，及时盖好容器塞。10 细管冻精质量评价 10.1 细管冻精质量检验规则和方法 每季度每头公猪细管冻精型式检验不少于一次，检验方法按照GB 4143进行。出站时应检验细管冻精外观和精液品质，检验合格方可交付使用。10.2 细管冻精型式检验质量评价 10.2.1 细管外观 细管无裂痕、两端封口严实。10.2.2 剂量 精液剂量0.18 ml。10.2.3 精子活力 精子活力30%。10.2.4 精子畸形率 精子畸形率18%。10.2.5 精子密度 每毫升精液精子密度3108个。10.2.6 细菌数 精液中细菌数800个。_