DB34T 1838-2013 动物源性组织中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱荧光法.pdf

ICS 67.120 X 04 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 18382013 动物源性组织中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱荧光法 Determination of residues of nitrofuran metabolites in animal tissue-HPLC fluorescent method 2013-02-04 发布 2013-03-04 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 18382013 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽省质量技术监督局、安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会提出。本标准由安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会归口。本标准起草单位：阜阳师范学院、亳州市产品质量监督检验所、安徽国家农业标准化与监测中心。本标准主要起草人：盛良全、陈明明、胡晓娟、王志强、吴平华、徐华杰、杜娜娜。DB34/T 18382013 1 动物源性组织中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱荧光法 1 范围 本标准规定了动物源性组织中硝基呋喃类药物代谢物3-氨基2-唑烷基酮（AOZ）、5-吗啉甲基-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、1-氨基-乙内酰脲（AHD）和氨基脲（SEM）残留量的高效液相色谱荧光测定方法。本标准适用于动物源性组织中硝基呋喃类药物代谢物3-氨基-2-唑烷基酮、5-吗啉甲基-3-氨基-2-唑烷基酮、1-氨基-乙内酰脲和氨基脲残留的定量测定。本标准适用于该产品的风险预警监测及相关科学研究。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 样品经稀盐酸水解，在 50水浴下用2-羟基-1-萘甲醛衍生 2 h，然后，用乙酸乙酯提取。净化后采用高效液相色谱法（荧光检测器）测定，外标法定量。4 试剂和材料 4.1 试剂：除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。4.2 甲醇：色谱纯。4.3 乙腈：色谱纯。4.4 乙酸乙酯：色谱纯。4.5 浓盐酸：优级纯。4.6 氢氧化钠：优级纯。4.7 硼酸。4.8 2-羟基-1-萘甲醛（2-NAH）：含量99。4.9 氯化钾。4.10 0.40 mol/L 盐酸溶液：准确量取 33.30 mL 浓盐酸(4.4)，用水定容至 1 L。4.11 0.50 mol/L 氢氧化钠溶液：准确称取 5 g 氢氧化钠(4.5)，用水溶解并定容至 250 mL。4.12 0.025 mol/L 2-羟基-1-萘甲醛溶液：准确称取 0.4305 g 2-羟基-1-萘甲醛（4.7)，用甲醇溶解并定容至 100 mL。DB34/T 18382013 2 4.13 标准物质：3-氨基-2-恶唑酮、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮、1-氨基-乙内酰脲、氨基脲，纯度99。4.14 标准储备液：分别准确称取适量标准品（精确至 0.0001 g），用甲醇溶解，配制成浓度为 400 mg/L的标准储备溶液，-18冷冻避光保存，有效期 3 个月。4.15 混合中间标准溶液：准确移取标准储备液(4.13)各 1 mL 于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为 40 mg/L 的混合中间标准溶液，4冷藏避光保存，有效期 1 个月。4.16 混合标准工作溶液：准确移取 0.5 mL 混合中间标准溶液(4.14)于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为 2 mgL 的混合标准工作溶液，4冷藏避光保存，有效期 1 周。建议现配现用。4.17 微孔滤膜：0.45 m 的有机系和水系滤膜。4.18 氮气：纯度99。5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪：配备多波长荧光检测器。5.2 组织捣碎机。5.3 分析天平：感量 0.0001 g、0.01 g。5.4 数显恒温水浴锅。5.5 pH 计：测量精度 0.02 pH 单位。5.6 高速冷冻离心机：10000 r/min。5.7 台式离心机：4000 r/min。5.8 氮吹仪。5.9 超声波清洗机。5.10 容量瓶：l L、100 mL、50 mL、25 mL、10 mL。5.11 具塞塑料离心管：50 mL。5.12 刻度试管：l0 mL。5.13 微量进样器 100 L、50 L、10L。6 试样制备与保存 从原始样品取出有代表性样品约 500 g，用组织捣碎机充分捣碎混匀，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记，将试样置于-18冷冻避光保存。注：在制样的操作过程中，应防止样品污染或残留物含量发生变化。7 样品处理 7.1 水解和衍生化 称取约 5.00 g 试样（精确至 0.0l g）于 50 mL 塑料离心管中，加入 10 mL 甲醇-0.40 mol/L盐酸混合溶液（7+3，体积比），混匀超声 40 min 后，再加入 0.20 g 氯化钾，混匀后再超声 30 min，然后，以 7200 r/min 离心 40 min，倾倒上清液于 10 mL 玻璃试管中，再加入2-羟基-1-萘甲醛溶液(4.7)200 L，振荡摇匀后超声 10 min，置 50 恒温水浴锅中反应 2 h。7.2 提取和净化 DB34/T 18382013 3 取出样品，冷却至室温，在 60下用氮气吹至 1 mL，加入 4 mL 超纯水，再加入 5 mL 乙酸乙酯，振荡提取 5 min 后，以 10000 r/min 离心 5 min，收集乙酸乙酯层，残留物用 5 mL 乙酸乙酯再提取一次，合并乙酸乙酯层。收集液在 40下用 N2 吹至近干后用 1 mL 的乙腈水溶液(V乙腈:V水=8:2)重新复溶，用 0.45 m 有机滤膜过滤后,转移入进样瓶待进样。7.3 工作曲线 移取适量 AMOZ、AHD、AOZ、SEM 混合标准工作溶液，添加到 10 mL 甲醇-0.40 mol/L 盐酸混合溶液（7+3，体积比）中，使其浓度分别为 0.5 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL 和 20.0 ng/mL，按 7.17.2 测定步骤处理，用高效液相色谱仪测定，绘制标准工作曲线。或采用与待测物相近浓度的标样进行单点测定。8 测定 8.1 液相色谱条件 8.1.1 色谱柱：YMC-Pack PolymerC18，2504.6 mml.D.S-6 m，或相当者；8.1.2 柱温：40；8.1.3 流速；0.7 mL/min；8.1.4 进样量：20 L；荧光检测条件:灵敏度（EUFS）：500，增益（Gain）:10；通道 1：激发波长(Ex):395 nm 发射波长(Em)：463 nm；通道 2：激发波长(Ex):260 nm 发射波长(Em)：463 nm；8.1.5 流动相及洗脱条件见表 1。表1 流动相及梯度洗脱条件 时间 min 流动相 A:0.01 mol/L 硼酸缓冲液（pH=10.30）流动相 B:乙腈-0.01 mol/L 硼酸缓冲液（pH=9.40，体积比 50:50）0.00 70 30 3.00 50 50 8.00 15 85 35.00 15 85 40.00 70 30 45.00 70 30 8.2 平行试验 按照以上步骤对同一试样进行平行试验测定。8.3 空白试验 除不称取试样外，均按照以上步骤进行。9 结果计算 按式(1)进行计算：DB34/T 18382013 4 mAVCACSS.(1)式中：C 试样中分析物的含量，单位为微克每千克(gkg)；Cs 从工作曲线中得到与被测组分相近的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；A 被测试样的峰面积；As 对应 Cs 标准的峰面积；V 样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m 样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。注：计算结果需将空白值扣除。10 方法灵敏度、回收率和精密度 10.1 灵敏度 本方法 AMOZ、AOZ、AHD、SEM 的检出限（LOD）低于 0.5 gkg；最低定量限(LOQ):AMOZ、AOZ均0.5 gkg，AHD、SEM 均1.0 gkg。10.2 回收率 添加浓度在 1 gkg、5 gkg、10 gkg 时，AMOZ、AOZ、AHD、SEM 回收率在 80115之间。10.3 精密度 本方法批内和批间相对标准偏差15。DB34/T 18382013 5 A A 附 录 A（资料性附录）四种硝基呋喃代谢物实际样品荧光色谱图 图A.1 样品基质添加四种硝基呋喃类代谢物标样色谱图（激发波长：395 nm，发射波长：463 nm）图A.2 样品基质添加四种硝基呋喃类代谢物标样色谱图（激发波长：260 nm，发射波长：463 nm）_