DB22T 2052-2014 饲料中沙门氏菌测定 实时荧光PCR方法.pdf

ICS 07.100.30 B 20 备案号：41840-2014 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 20522014 饲料中沙门氏菌测定 实时荧光 PCR 方法 Determination of salmonella in feedstuffs Real-time PCR method 2014-02-28 发布 2014-04-30 实施 吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20522014 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、王伟、刘晓晖、赵立群、侯宇、柴竹林、张涛。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20522014 1 饲料中沙门氏菌测定 实时荧光 PCR 方法 1 范围 本标准规定了饲料中沙门氏菌的实时荧光PCR检验方法。本标准适用于饲料中沙门氏菌的快速筛选检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的检验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 实时荧光PCR real-time fluorescent PCR 实时荧光聚合酶链式反应。3.2 Ct值 cycle threshold value 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 原理 对样品的增菌培养物进行DNA提取，通过实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对饲料中的沙门氏菌进行快速检测。5 试剂和培养基 除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T 6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1 引物及探针：a)上游引物：5-GTGAAATAATCGCCACGTCGGGCAA-3 b)下游引物：5-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20522014 2 c)探针：5-FAM-TTATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTAMRA-3 5.2 Taq DNA 聚合酶。5.3 dNTP：dATP（deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。5.4 细菌基因组 DNA 提取纯化试剂盒。5.5 10PCR 缓冲液：含 200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L 氯化钾（KCl），15 mmol/L 氯化镁（MgCl2）。5.6 缓冲蛋白胨水（BPW）：按 GB/T 13091 中附录规定。5.7 沙门氏菌质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的标准菌株。如 CGMCC1.1859、CGMCC1.1194 等。6 设备和材料 6.1 实时荧光 PCR 仪。6.2 生物安全柜：AII 型。6.3 恒温培养箱。6.4 离心机：转速12 000 r/min。6.5 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.6 高压灭菌器。6.7 恒温水浴锅。6.8 天平：感量 0.1 g。6.9 移液器：0.2 L2 L、2 L10 L、20 L200 L、100 L1 000 L。6.10 均质器或乳钵。6.11 涡旋混合器。6.12 实时荧光 PCR 反应管。6.13 离心管：1.5 mL。7 检测步骤 7.1 样品制备与增菌 参照GB/T 13091进行。7.2 模板 DNA 的提取 取BPW增菌液1 mL于1.5 mL无菌离心管中，12 000 r/min离心5 min，尽量吸弃上清液，使用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。提取的DNA溶液可于-20 保存。DNA提取和纯化过程应用无菌水作为核酸提取空白对照。7.3 DNA 浓度测定 取10 L DNA溶液加蒸馏水稀释至1 mL，使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算，当A260/A280比值在1.52.1之间时，适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA调至10 ng/L50 ng/L。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20522014 3 501000ANc=.(1)式中：c DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/L）；A 260 nm处的吸光值；N 核酸稀释倍数。7.4 实时荧光 PCR 检验 7.4.1 实时荧光 PCR 反应体系 10PCR缓冲液2.5 L、引物对（10 mol/L）各1 L、探针（10 mol/L）1 L、dNTP（10 mmol/L）1 L、Taq DNA聚合酶（5 U/L）0.5 L、模板DNA 2 L、用灭菌去离子水补足体积至25 L。7.4.2 实时荧光 PCR 反应条件 94 预变性2 min，94 变性20 s，64 退火延伸1 min，同时收集FAM荧光，共进行40个循环。反应产物可在4 保存。不同仪器、不同Taq DNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。检验过程中分别设空白对照、阴性对照、阳性对照。空白对照设为以无菌水代替DNA模板；阴性对照采用非沙门氏菌的DNA作为实时荧光PCR反应的模板；阳性对照采用沙门氏菌DNA作为实时荧光PCR反应的模板。8 结果与判断 8.1 质量控制 空白对照：无扩增曲线，Ct 值40.0；阴性对照：无扩增曲线，Ct 值40.0；阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct 值应35.0；否则，视为无效。8.2 结果判定 Ct 值40.0，可判定样品实时荧光 PCR 结果为阴性。Ct 值35.0，可判定该样品实时荧光 PCR 结果为阳性，按 GB/T 13091 进行确证。35.0Ct 值40.0，此时应适当增加 DNA 模板量重做实时荧光 PCR 检测。重做结果 Ct 值40.0 者为阴性，否则实时荧光 PCR 结果为阳性，按 GB/T 13091 进行确证。9 结果表述 9.1 实时荧光 PCR 结果阴性，可直接报告未检出沙门氏菌。9.2 确证试验结果为检出沙门氏菌，则报告检出沙门氏菌。9.3 确证试验结果为未检出沙门氏菌，则报告未检出沙门氏菌。10 生物安全措施 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20522014 4 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测沙门氏菌，所有培养物和废弃物应小心处置，并按GB/T 27403中的有关规定执行。11 废弃物处理和防止污染的措施 11.1 检验过程中的废弃物需经 121 高压灭菌处理至少 30 min 后再弃置。11.2 检验过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 27403 执行。_ 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印