DB32T 1824-2011 禽肉肌纤维特性的测定 石蜡切片法.pdf

ICS 65.020.30B 40备案号：江苏省地方标准DBDBDBDB32323232DB32/T18242011禽肉肌纤维特性的测定石蜡切片法Determination of poultry muscle fiber characteristicParaffin section method2011-06-15 发布2011-08-15 实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T 18242011I前言本标准按GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构与编写的规定编写。本标准由江苏省家禽科学研究所提出。本标准起草单位：江苏省家禽科学研究所、农业部家禽品质监督检验测试中心（扬州）、扬州翔龙禽业发展有限公司。本标准主要起草人：唐修君、高玉时、王克华、葛庆联、陆俊贤、施祖灏、张小燕、蒲俊华。DB32/T 182420111禽肉肌纤维特性的测定石蜡切片法1范围本标准规定了石蜡切片法测定禽肉肌纤维特性的术语和定义、试剂与配制、仪器和设备、样品处理、切片制作、读片与计算、数据纪录和允许差。本标准适用于石蜡切片法测定禽类肌纤维密度、直径、间距、肌束间距以及肌大束间距。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本部分。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本部分。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准3.1肌纤维密度Muscle fiber density同一肌束内，单位面积肌纤维根数。3.2肌纤维直径Muscle fiber diameter肌纤维长径与短径的几何平均数。3.3肌纤维间距 Muscle fiber gap同一肌束内，相邻肌纤维之间的垂直距离。3.4肌束间距 Muscle bundle gap同一肌大束内，相邻肌束之间的垂直距离。3.5肌大束间距 Distance between muscle bundles相邻肌大束之间的垂直距离。4试剂与配制DB32/T 182420112除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯，用水符合 GB/T 6682 一级水的规定。4.14%甲醛溶液1 体积甲醛与 9 体积水混匀。4.2无水乙醇4.375%酒精7.5 体积无水乙醇与 2.5 体积水混匀；85%酒精：8.5 体积无水乙醇与 1.5 体积水混匀；95%酒精：9.5体积无水乙醇与 0.5 体积水混匀。4.4二甲苯4.5石蜡65反复提炼，直至蜡的颜色泛黄可用。4.6苏木素4.71%盐酸酒精1 体积盐酸与 99 体积无水乙醇混匀。4.80.5%伊红酒精称取 0.5g 伊红，用 100mL 无水乙醇溶解。4.9中性树脂5仪器和设备5.1 组织切片机切片厚度 5m1000m。5.2 烘箱精度1。5.3 恒温水浴锅精度1。5.4 包埋框5.5 镊子使用之前放入 60烘箱中预热。5.6 载玻片和盖玻片用洗液浸泡 24h 后用自来水充分洗涤，再用 95%酒精浸泡后用软绸布或纱布擦干，待用。5.7 光学显微镜DB32/T 182420113放大倍数 104 至 1040。6样品处理6.1取样与固定家禽宰杀放血后，在 30min 内顺着肌纤维方向取样，胸肌取样部位为胸大肌前端 1/3、距龙骨 2cm处，腿肌取样部位为大腿肌中部，距股骨 1cm 处，取样大小为长宽高约 2cm1 cm1 cm。剔除肌肉表面筋、腱、膜及脂肪，随即置于 4%甲醛溶液中固定 10h，取出修成 0.7cm0.6 cm0.4cm 大小的组织块，重新置于 4%甲醛溶液中继续固定 12 h。6.2洗涤将组织样置于流动的自来水下，浸泡 10h15h。6.3脱水采用不同浓度的酒精对组织样进行梯度脱水，脱水步骤、酒精浓度和各步骤所需时间见表 1。表 1脱水步骤、酒精浓度和各步骤所需时间步骤酒精浓度时间一75%2h4h二85%2h4h三95%2h4h四无水乙醇2h3h五无水乙醇2h3h6.4透明将组织放进二甲苯中浸泡 10min 15min，至组织呈半透明或透明状态，用肉眼可观察到透明感时立即取出。6.5浸蜡和换蜡6.5.1浸蜡：将透明好的组织块完全置于 60石蜡中浸泡 2h。6.5.2换蜡：将蜡块取出立即另置于 60新蜡中再浸泡 2h 左右。6.6包埋和修块将熔化的石蜡倒入包埋框，待蜡将近凝固之前，用镊子将组织块放至包埋框接近底部的位置，使肌纤维长轴与待切面垂直，将准备好的标签放在待凝固的蜡上面，完全自然冷却后，切去余蜡部分，根据需要适当修整蜡块，一般修成方形或梯形。7切片制作7.1切片、展片和贴片、烤片7.1.1切片：使用组织切片机切片，切片厚度宜为 7m，前 15 张切片一般不用。7.1.2展片和贴片：将切好的蜡片轻轻平铺于 10-20水中展片，用载玻片从切片下面轻轻捞起，立DB32/T 182420114即置于 40恒温水浴锅中贴片，切片和载玻片之间不应有气泡。7.1.3烤片：将粘有切片的载玻片置于 60烘箱内烤片 24h。7.2染色切片烤片后采用二甲苯两次脱蜡、梯度酒精洗二甲苯，之后进行苏木素-伊红（HE）染色。各步骤名称、所需试剂和时间见表 2表 2切片染色各步骤名称、所需试剂和时间步骤名称试剂时间一脱蜡二甲苯10min二再脱蜡二甲苯10min三洗二甲苯（）95%乙醇1min四洗二甲苯（）85%乙醇1min五洗二甲苯（）75%乙醇1min六洗酒精自来水1min七染色苏木素10-20min八水洗自来水至切片呈淡蓝色九分化1%盐酸酒精1s十水洗自来水返蓝即可十一染色0.5%伊红酒精20s十二水洗自来水多次水洗，至切片红色变淡7.3封片如需长期保存切片，则应进行封片。切片晾干后，使用中性树脂封片，中性树脂的量以封片后能完全盖住切片为宜，封片过程中不应有气泡。8读片与计算8.1 肌纤维密度随机取3张切片，每张切片取3个或3个以上视野，在1010倍显微镜下读出每个视野肌纤维根数，求加权平均数，按公式（1）计算。X=（X1/Y1X2/Y2X3/Y3 Xn/Yn）106/N（1）式中：X肉样肌纤维密度，单位为根每平方毫米（根/mm2）；X1n每个视野中肌纤维根数，单位为根；Y1n每个视野面积，单位为平方微米（um2）；N视野数（大于或等于9）。8.2 肌纤维直径随机取3张切片，每张切片取3个视野，每个视野取10根或10根以上肌纤维，在1040倍显微镜下，测量每根肌纤维长径和短径距离，算出几何平均值，再求加权平均数，按公式（2）计算。X=（X1Y1）/2（X2Y2）/2（X3Y3）/2（XnYn）/2/N（2）DB32/T 182420115式中：X肉样肌纤维直径，单位为微米（m）；X1n肌纤维长轴距离，单位为微米（m）；Y1n肌纤维短轴距离，单位为微米（m）；N肌纤维根数（大于或等于90）。8.3 肌纤维间距随机取3张切片，每张切片取3个视野，每个视野测量10个或10个以上间距，在1040倍显微镜下，测量每个间距距离，求加权平均数，按公式（3）计算。X=（X1X2X3Xn）/N（3）式中：X肉样肌纤维间距、肌束间距或肌大束间距，单位为微米（m）；X1n每个肌纤维间距、肌束间距或肌大束间距，单位为微米（m）；N间距数（大于或等于90）。8.4 肌束间距按8.3执行。8.5 肌大束间距按8.3执行。9数据记录记录数据时应仔细填写所取肉样种类、取样部位及检测数据，计算结果保留两位有效数字。10允许差同一肉样，有效区域的测定值允许的相对偏差应15%。