DB32T 906-2006 动物饲料和饮用水中已烯雌酚的测定 酶联免疫法.pdf

ICS65.020.01 B46 备案号：18651-2006 江苏省地方标准 DB32/T 9062006 动物饲料和饮用水中己烯雌酚的测定 酶联免疫法 Determination of Diethylstilbestrol in animal feeding stuffs and water by ELISA 2006-03-25 发布 2006-05-25 实施 江苏省质量技术监督局 发布 DB32 DB32/T 9062006 前 言 为了加强对己烯雌酚的有效监控，进一步规范畜禽养殖中投入品的管理，特制定本标准，以从源头上监控己烯雌酚的非法使用，从而保证畜产品的安全和人民身体健康。本标准按照GB/T1.1-2000标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则和GB/T1.2-2000标准化工作导则 第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法编写。本标准由江苏省农林厅提出。本标准起草单位：江苏省饲料监察所。本标准主要起草人：耿士伟、时勇、邵德佳、毕昊容、冯三令、储瑞武、贾书静。DB32/T 9062006 1 动物饲料和饮用水中己烯雌酚的测定 酶联免疫法 1 范围 本标准规定了动物饲料和饮用水中己烯雌酚（DES）酶联免疫法测定的原理、试剂和材料、仪器、试样分析、允许差。本标准适用于酶联免疫法测定动物饲料和饮用水中己烯雌酚的量。方法最低检出限为5g/kg。2 原理 测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对兔IgG（己烯雌酚抗体，简称DES抗体）的羊抗体。加入DES抗体，标准或样品溶液。己烯雌酚与DES抗体连接，同时DES抗体也与羊抗体连接。洗涤步骤后，加入DES酶标记物，DES酶标记物与孔中的未结合的（空位）DES抗体连接，然后在洗涤步骤除去未结合的DES酶标记物。将酶基质和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育。结合的DES酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝色转变为黄色。在450nm处测量，吸收光强度与样品中的DES浓度成反比。3 试剂和材料 3.1 甲醇，分析纯。3.2 滤纸，定性滤纸。3.3 80%甲醇水溶液：量取 80mL 甲醇，加入蒸馏水至 100mL。3.4 40%甲醇水溶液：量取 40mL 甲醇，加入蒸馏水至 100mL。4 仪器 4.1 恒温培养箱。4.2 粉碎机。4.3 振荡器。4.4 酶标仪。4.5 微量移液枪：单道 1mL5mL 可调、10L100L 可调和多道 50L250L 可调。5 试样分析 5.1 样品提取 5.1.1 饲料 称取2.0g粉碎后的饲料于50mL离心管中，加入80%甲醇水溶液20mL于振荡器上振荡3min，滤纸过滤后取滤液1mL，加入1mL蒸馏水稀释。取稀释液1mL，加入40%甲醇水溶液9mL，摇匀，供酶联免疫吸附测定用。5.1.2 饮用水 直接量取1mL，加入40%甲醇水溶液4mL，摇匀，供酶联免疫吸附测定用。5.2 测定 使用前将试剂盒及处理后的试样在室温（2024）下放置1h2h回温。5.2.1 将标准和试样（按双平行实验计算）所用数量的孔条插入微孔架，记录标样和试样的位置。加入 20L 标样以及处理好的样品液到各自的微孔中。标样和样品做两个平行实验。DB32/T 9062006 2 5.2.2 加入 50L 稀释后的 DES 抗体到每一个微孔中。在平面上做圆周运动以充分混后并覆盖上薄膜，在 28孵育 20h。5.2.3 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打 3 次），以充分除去孔中的液体。用 250L 样品洗涤缓冲液充入孔中，再次倒掉孔中液体，再重复两次上述操作。5.2.4 加入 50L 稀释的酶标记物到微孔底部，在平面上做圆周运动以充分混合，室温孵育 1h，覆盖上薄膜。5.2.5 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打 3 次），以充分除去孔中的液体。用 250L 样品洗涤缓冲液充入孔中，再次倒掉孔中液体，再重复两次上述操作。5.2.6 加入 50L 基质和 50L 发色剂到每一个微孔中，充分混合并在室温暗处孵育 30min。5.2.7 加入 100L 反应终止液每一微孔中，混合好在 450nm 处测量吸光值。5.3 结果计算 用所获得的标样和试样溶液吸光度值与空白溶液的比值按式（1）计算：R（%）B B0 100（1）式中：R相对吸光度值；B标样（或试样）溶液的吸光度值；B0空白（浓度为0的标准溶液）的吸光度值。将计算的相对吸光度值（%）对应的己烯雌酚（DES）浓度（ng/L）的自然对数作半对数坐标系统曲线图，校正曲线在50ng/L200 ng/L内呈线性，对应的试样浓度可从校正曲线算出。试样中己烯雌酚的量按式（2）计算。XAm 1000 （2）式中：X试样中己烯雌酚（DES）的含量，单位为微克每千克或微克每升g/kg(g/L)；A试样的相对吸光度值（%）对应的己烯雌酚（DES）含量，单位为纳克每升（ng/L）；试样稀释体积，单位为毫升（mL）；m试样的取样量，单位为克或毫升g(mL)。计算结果表示到小数点后两位。6 允许差 同一分析者同一试验两次平行测定结果的相对偏差不大于 20%