DB22T 396.4-2017 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第4部分：皮肤刺激性试验.pdf

1 ICS 11.020 C 05 备案号：58323-2018 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 396.42017 代替 DB22/T 396-2014保健用品毒理学评价程序与检验方法 第 4 部分：皮肤刺激性试验 Toxicological evaluation procedures and test methods for health care products Part 4:Skin irritation test 2017-11-10 发布 2017-12-30 实施吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 前 言 DB22/T 396-2017保健用品毒理学评价程序与检验方法拟分为如下部分：第 1 部分：评价程序；第 2 部分：急性经皮毒性试验；第 3 部分：长期经皮毒性试验；第 4 部分：皮肤刺激性试验；第 5 部分：皮肤变态反应试验；第 6 部分：细菌回复突变试验；第 7 部分：啮齿动物微核试验；第 8 部分：小鼠精子畸形试验；第 9 部分：哺乳动物培养细胞染色体畸变试验；第 10 部分：致畸试验；第 11 部分：致癌试验；第 12 部分：人体皮肤斑贴试验。本标准为 DB22/T 396-2017 的第 4 部分。本部分按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本部分代替DB22/T 396-2014保健用品毒理学评价程序与检验方法，与DB22/T 396-2014相比，结构做了较大调整。除编辑性修改外，主要技术内容变化如下：增加了警示；增加了范围；增加了仪器；增加了附录 A；增加了附录 B。本部分由吉林省卫生与计划生育委员会提出并归口。本部分起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本部分主要起草人：孟令仪、张晶莹、宋昕恬、孙兰、吴晓刚、隋自洁、高峰。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：DB22/T 396-2004；DB22/T 396-2014。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 保健用品毒理学评价程序和检验方法 第 4 部分：皮肤刺激性试验 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了保健用品毒理学皮肤刺激性试验评价程序。本标准适用于保健用品毒理学皮肤刺激性试验检验方法。2 皮肤刺激性试验检验方法 2.1 材料 2.1.1 动物 多种哺乳动物均可被选为实验动物，首选白色家兔。应使用成年、健康、皮肤无损伤的动物，雌性和雄性均可，但雌性动物应是未孕和未曾产仔的。实验动物至少要用4只。实验动物应单笼饲养，试验前动物要在实验动物房环境中至少适应3d时间。实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用常规饲料，饮水不限制。2.1.2 受试物 液态受试物一般不需稀释，可直接使用原液，膏状受试物，可直接使用原膏霜。若受试物为固体，应将其研磨成细粉状，并用水或其它无刺激性溶剂充分湿润，以保证受试物与皮肤有良好的接触。使用其它溶剂，应考虑到该溶剂对受试动物皮肤刺激性的影响。受试物为强酸或强碱（pH值2或11.5），可以不再进行皮肤刺激试验。此外，若已知受试物有很强的经皮吸收毒性，经皮LD 50小于200 mg/kg BW或在急性经皮毒性试验中受试物剂量为5000 mg/kg BW仍未出现皮肤刺激作用也无需进行急性皮肤刺激性试验，LD 50计算见附录B。2.1.3 仪器 2.1.3.1 体重秤,精确到 0.1 Kg；2.1.3.2 放大镜。2.2 试验方法 2.2.1 皮肤急性刺激试验（一次皮肤涂抹试验）皮肤急性刺激试验步骤：a)试验前约 24 h，将实验动物背部脊柱两侧毛剪掉，不可损伤表皮，去毛范围左、右各约 3 cm3 cm；b)取受试物约 0.5 mL（g）直接涂在皮肤上，然后用二层纱布（2.5 cm2.5 cm）和一层硫酸纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。另一侧皮肤作对照。采用封闭试验，敷用时间本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 2 为 4 h。可根据人的实际使用和产品类型，延长或缩短敷用时间。对用后冲洗的产品，仅采用 2 h敷用试验。实验结束后用温水或无刺激性溶剂清除残留受试物。如怀疑受试物可能引起严重刺激或腐蚀作用，可采取分段试验，将三个涂有受试物的纱布块同时或先后敷贴在一只家兔背部脱毛区皮肤上，分别于涂敷后 3 min、60 min 和 4 h 取下一块纱布，皮肤涂敷部位在任一时间点出现腐蚀作用即可停止试验；c)于清除受试物后的 1 h、24 h、48 h 和 72 h 观察涂抹部位皮肤反应，按表 1 进行皮肤反应评分，以受试物积分的平均值进行综合评价，根据 24 h、48 h 和 72 h 各观察时间点最高积分均值，按表 2 判定皮肤刺激强度；d)观察时间的确定应足以观察到可逆或不可逆刺激作用的全过程，一般不超过 14 h。表 1 皮肤刺激反应评分 刺激反应 分值 红斑：无红斑 0 勉强可见 1 中度红斑 2 严重红斑 3 紫红色红斑并有焦痂形成 4 水肿：无水肿 0 勉强可见 1 轻度可见(边缘高出周围皮肤)2 反肤隆起约 1mm 轮廓清楚 3 水肿隆起 1mm 以上并范围扩大 4 最高总分值 8 表 2 皮肤刺激强度分级 刺激强度 平均分值 无刺激性 0.00.49 轻度刺激性 0.52.99 中度刺激性 3.05.99 强刺激性 6.08.00 2.2.2 皮肤慢性刺激试验(多次皮肤涂抹试验)皮肤慢性刺激试验步骤：a)试验前将实验动物背部脊柱两侧皮肤的毛剪掉，去毛范围各为 3 cm3 cm，涂抹面积 2.5 cm2.5 cm；本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 b)取受试物约 0.5 mL(g)涂抹在一侧皮肤上，当受试物物无刺激性溶剂配制时，另一侧涂溶剂作为对照，每天涂抹 1 次，连续涂抹 14 d。从第二天开始，每次涂抹前应剪毛，用水或无刺激性溶剂清除残留受试物。1 h 后观察结果，按表 1 评分，对照区和试验区同样处理。2.3 结果评价 按下列公式计算每天每只动物平均积分，以表 2 判定皮肤刺激强度。nkK1.(1)式中：k每天每只动物平均积分；1k红斑和水肿积分；n受试动物数。A 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 4 附 录 A（规范性附录）实验动物体表面积估算方法 A.1 兔 32mks.(A.1)式中：s体表面积，cm2；k常数，一般成年家兔为 10；m动物体重，g。例：体重 2 kg 成年家兔体表面积：32200010s 21588S2008.32008.213010.3667.012000lg3210lglgcmS查反对数表：A.2 豚鼠 32mks.(A.2)式中：s体表面积，cm2；k常数，26.9k；m动物体重，g。例:体重 438 g 豚鼠的体表面积：2534S7276.27610.19666.08805.0329666.0438lg3226.9lglgcmS查反对数表：A.3 大鼠、小鼠 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 32mks.(A.3)式中：s体表面积，cm2；k常数，0913.0k；m动物体重，g。例：体重 200 g 大鼠的体表面积：322.00913.0s 2123.3S1945.25340.19605.23010.1329605.22.0lg320913.0lglgcmS查反对数表：本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 6 A B 附 录 B（规范性附录）LD50计算方法 B.1 霍恩氏法（Horn）一般各剂量组使用5只动物，常用的剂量系列有两排：100.1064.415.201.1t 106.310.1016.30.1t 3,2,1,0t 前排系列的剂量间距较后排系列为小，结果较为精确，所以一般常选用之。预备试验：通常采用10 mg/kg，100 mg/kg和1000 mg/kg的剂量，各剂量使用2只3只动物。根据24 h内动物死亡情况，估计LD50的可能范围，以确定正式试验所用的剂量。正式试验:按预试所确定大概的致死剂量范围选用一组适宜的剂量系列，根据四个剂量组的动物死亡数，从Horn氏法LD50计算用表中，可求出LD50值及其可信限。此法的优点是简单易行，使用动物少，可用来初步了解受试物的毒性强弱。缺点是所得LD50的可信限范围较宽，不够精确。B.2 机率单位对数图解法 先把剂量的对数值和相应反应的机率单位用点代表画在图上（用机率对数图纸直接把剂量和死亡百分数画在图上）。画线时应照顾所有图上各点，使点散布在线的上下，并使线上点的距离和线下点的距离能相互抵消，特别注意在死亡率15%到85%间的点，机率单位4与6之间的点，尽量使线接近这部分的点。当直线划定后，由图直线上50%死亡率(机率单位为5)的相应剂量对数值，就是半数致死量（LD50）的对数值，经反对数变换后即得LD50的剂量。半数致死量（LD50）可信限估计：先求50LD的标准差S按式（A.1）：1212yyxxs.(B.1)式中：2x、1x相当于62y、41y（概率单位）时相应的X轴上的对数剂量。估计50logLD的标准误按式(B.2)本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 396.42017 1215022lognsnsLD或.(B.2)式中：1n反应百分率为16%84%之间所用试验动物数。半数致死量对数值的95%可信限为sLD96.1log50 该法要求：一般每剂量组使用不少于10只动物。但各组动物数不一定均等。此法不要求剂量组呈等比关系，但等比可使各点距离相等，利于作图。本法优点是，不需烦琐的计算。B.3 寇氏法(Karbermettod)该法是一种计算简便，易于理解，而且计算结果比较准确的一种方法。依本方法设计时，剂量范围可宽些，剂量组必须多，但组间对数剂量差(组距)可以小些。预备试验：一般应求得动物全死(或90%以上死亡的剂量)和动物不死亡（或10%以下死亡的剂量），分别作为正式试验的最高与最低剂量。正式试验：一般设5 个10 个剂量组。将上述最高、最低剂量均换算为常用对数，然后将最高、最低剂量的对数差，按所需要的组数，分为几个对数等距（也可以不等距）的剂量组。试验结果的计算和统计：a)列出试验数据及其计算表：包括各组剂量（mg/kg）、对数剂量（X）、动物数（n）、动物死亡(r)、动物死亡百分比（P，以小数表示）以及统计公式中要求的其他计算数据项目；LD50的计算公式：根据试验条件及试验结果，可分别选用下列三个公式中的一个，求出 LD50；1)按本试验设计得出的任何结果，均可用式(A.3)计算：iiiippxxLD115021log.(B.3)式中：ix与1ix及ip与1ip分别为相邻两组的剂量对数以及动物死亡百分比 2)按本试验设计