DB32T 2583-2013 饲料中饲用芽孢杆菌的测定.pdf

ICS65.120 B22 备案号：40469-2014 江苏省地方标准 DB32DB32/T 2583-2013 饲料中饲用芽孢杆菌的测定 Determination of Bacillus in feed 2013-12-20 发布 2014-01-20 实施江苏省质量技术监督局 发 布 DB32/T 2583-2013 前 言 本标准编写按GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的规定。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准由江苏省农业科学院畜牧研究所、江苏省动物卫生监督所负责起草。本标准主要起草人为宦海琳、周维仁、闫俊书、白群安。DB32/T 2583-2013 1 饲料中饲用芽孢杆菌的测定 1 范围 本标准规定了饲料中饲用芽孢杆菌的测定方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、预混料、饲料添加剂中饲用芽孢杆菌的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 GB/T 4789.2-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定（原文中的参考文献）3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 芽孢杆菌 bacillus 一类能形成芽孢（内生孢子）的杆状细菌的通称。与饲料工业密切相关的芽孢杆菌主要为芽孢杆菌属(Bacillus)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subulis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、迟缓芽孢杆菌（Bacillus lentus）和短芽孢杆菌属(Brevilbacillus)的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)。3.2 菌落数 aerobic plate count 饲料检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。4 原理 取一定量检样的稀释液，将其在8 0 下加热10 m i n，涂布在NA琼脂内，于36 条件下培养48 h，菌落计数，算出每g（mL）检样中的芽孢杆菌总数。5 设备和材料 5.1 分析天平 感量0.1 g，0.1 mg。5.2 振荡器 5.3 粉碎机 DB32/T 2583-2013 2 非旋风磨，密闭要好。5.4 恒温水浴锅 5.5 恒温培养箱 5.6 pH计（精确到0.1个单位）或精密pH试纸 5.7 灭菌锥形瓶 500mL、250mL。5.8 无菌吸管 1 mL（具0.01刻度）、10 mL（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。5.9 灭菌试管 18 mm180 mm、15 mm150 mm。5.10 灭菌玻璃珠 5.11 灭菌玻璃或塑料培养皿 5.12 玻璃涂布棒 5.13 光学显微镜 1000倍。6 稀释液、培养基和试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸馏水或去离子水，或相当纯度的水。6.1 0.85%灭菌生理盐水 6.2 营养琼脂（NA）培养基 参见附录 A 中的 A.1。6.3 革兰氏染色液 参见附录中的 A.2。6.4 二乙酰（V-P）测定培养基和试剂 参见附录中的 A.3。6.5 L-阿拉伯糖发酵、D-木糖发酵、D-甘露醇发酵培养基 参见附录中的 A.4。6.6 明胶液化培养基 参见附录中的 A.5。6.7 淀粉水解培养基 参见附录中的 A.6。6.8 丙酸盐利用培养基 参见附录中的 A.7。6.9 柠檬酸盐利用培养基 DB32/T 2583-2013 3 参见附录中的 A.8。6.10 硝酸盐还原培养基和试剂 参见附录中的 A.9。6.11 7%氯化钠生长培养基 参见附录中的的 A.10。6.12 厌氧生长测定培养基 参见附录中的 A.11。7 检样的制备 按照GB/T 14699.1 进行采样，采样工具如铲子、匙、采样器、试管等，应是无菌的。样品送到微生物检验室应尽快检验。按照GB/T 20195进行检样的制备，样品制备后应尽快检验。8 操作步骤 8.1 试样稀释 8.1.1 以无菌操作称取试样 25 g（mL），放于含有 225 mL 0.85%灭菌生理盐水的灭菌三角瓶中（瓶内预置适当数量的玻璃珠），置振荡器上振荡 30 min，经充分振摇后，制成 1：10 的均匀稀释液。8.1.2 用无菌吸管或微量移液器吸取 1 mL 的 1:10 稀释液，沿管壁慢慢注入含有 9 mL 灭菌生理盐水的试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管，制成 1:100 的稀释液。根据样品含菌量，做进一步的十倍系列递增稀释液。8.2 接种和培养 选择 2 个-3 个适宜的稀释度，水浴 801维持 10 min，每个稀释度吸取 0.1 mL 稀释液接种到两个营养琼脂平板上，使用涂布棒进行表面涂布。涂布好的平皿盖好，置室温中放置 15 min 使接种物完全被琼脂吸收。翻转上述平皿置 36 1 培养箱中培养 48 h2 h。8.3 芽孢杆菌计数 用肉眼观察，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。8.3.1 选取菌落数在 30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的 平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平 均数。8.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用；而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释 度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以 2，代表一个平板菌落数。9 结果与报告 9.1 芽孢杆菌总数的计算方法 9.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平 均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）样品中菌落总数结果。9.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算。DB32/T 2583-2013 4 dnnCN)1.0(21?（1）式中：N样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。示例：稀释度 1:100 000（第一稀释度）1:1 000 000（第二稀释度）菌落数（CFU）232，244 33，35 24727272000022.054410)21.0(23533244232)1.0(521dnnCN?上述数据按 9.2.2 数字修约后，表示为 25 000 000 或 2.5107。9.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可 记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。9.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计 算。9.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。9.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU300 CFU 之间，其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 CFU 时，则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。9.2 芽孢杆菌总数的报告 9.2.1 菌落数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。9.2.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后 面用 0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。9.2.3 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。10 芽孢杆菌的鉴定（可选择）10.1 概述 目前商业上的生化鉴定试剂盒或生化鉴定管，如果采用的培养基与本标准鉴定试验所用的培养基一致，可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化鉴定管进行菌种鉴定 10.2 纯培养 自平板上挑取 5 个菌落，分别划线接种于营养琼脂平板上，36 1 培养箱中培养 48 h2 h，从每一平板上选取至少一个良好分离的特征菌落，转接保存，进行鉴定 10.3 形态观察 将挑选纯化的菌落做革兰氏染色镜检，饲用芽孢杆菌的菌落特征及染色镜检见表 1 10.4 生理生化鉴定 将挑选纯化的菌落进行二乙酰（V-P）测定、糖发酵、明胶液化、丙酸盐利用和 7%氯化钠生长试验。饲用芽孢杆菌的生理生化特征见表 2。DB32/T 2583-2013 5 表 1 饲用芽孢杆菌的菌落特征与芽孢特征 菌种 菌落特征 涂片镜检 枯草芽孢杆菌（B.subulis）菌落表面粗糙，不透明，边缘扩张，圆形或蔓延成波浪形、不规则性，灰白色或微黄色 细胞为杆状，有芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生，芽孢囊不明显膨大，革兰氏阳性 地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）菌落杏仁白色，表面暗到粗糙，不透明，扁平，边缘不整齐呈毛发状 细胞为杆状，单个、成对或短链排列，芽孢近椭圆形，中生，具有稀疏的周生鞭毛、能运动，芽孢囊稍膨大，革兰氏阳性 凝结芽孢杆菌（B.coagulans）边缘整齐，不透明，白色有光泽 细胞为杆状，单个、成对或短链排列，有芽孢，端生，革兰氏阳性 短小芽孢杆菌（B.pumilus）菌落近似圆形，白色，边缘不整齐，不透去，表面光滑，湿润，呈长杆状，单生或成双成串生长，芽孢呈椭圆形中生，稍膨大，革兰氏阳性 迟缓芽孢杆菌（B.lentus）菌落表面粗糙，不透明，灰白色 细胞为杆状，芽孢椭圆形，中生或近中生，芽孢囊不明显膨大，革兰氏阳性 侧孢芽孢杆菌（B.laterosporus）灰白色菌落，圆形、扁平、边缘光滑，中间稍呈轮状生长、蜡质、不产色素 细胞为杆状，芽孢为椭圆形，侧生、中生或近中生，芽孢囊膨大，革兰氏阳性 表 2 饲用芽孢杆菌的生理生化特征 项目 枯草芽孢 杆菌 B.subulis 地衣芽孢 杆菌 B.licheniformis 凝结芽孢 杆菌B.coagulans 短小芽孢 杆菌B.pumilus 迟缓芽孢 杆菌 B.lentus 侧孢短芽 孢杆菌B.laterosporus 厌氧生长 +V-P 测定+产酸 L-阿拉伯糖+d+D木糖+d+D-甘露醇+d+水解 明胶+d+淀粉+利用 柠檬酸盐+d+丙酸盐 +ND 硝酸盐还原+d d+pH5.7 生长+7%氯化钠生长+d d 55生长 +注：+表示 90%以上菌株阳性；表示 90%以上菌株阴性；d 表示 11%-89%菌株为阳性；ND 表示没有相关资料 DB32/T 2583-2013 1 附录 A（规范性附录）培养基及试剂 A.1 营养琼脂培养基 A.1.1 成分 名称 重量 蛋白胨 10 g 牛肉膏 3 g 氯化钠 5 g 琼脂 15 g20 g 蒸馏水 1000 mL A.1.2 制法 加热溶解，校正 pH 至 7.20.2，分装烧瓶，121高压灭菌 20min。A.2 革兰氏染色液 A.2.1 结晶紫染色液 A.2.1.1 成分 名称 重量 结晶紫 1.0 g 95乙醇 20 mL 1草酸铵水溶液 80 mL A.2.1.2 制法 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.2.2 革兰氏碘液 A.2.2.1 成分 名称 重量 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 mL A.2.2.2 制法 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 300 mL。A.2.3 沙黄复染液 A.2.3.1 成分 名称 重量 沙黄 0.25 g 95乙醇 10 mL 蒸馏水 90 mL A.