DB12T 843-2018 绿豆源成分检测 定性PCR法.pdf

ICS 65.020.20 B 04 DB12 天津市地方标准 DB12/T 8432018 绿豆源成分检测 定性 PCR 法 Mung bean-derived ingredients detectionQualitative PCR method 2018-11-07 发布 2018-12-01 实施 天津市市场和质量监督管理委员会 发 布 DB12/T 8432018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、浙江省农业科学院农产品质量标准研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：兰青阔、陈笑芸、王成、赵新、兰璞、王永、王庆平、汪小福、黄凤军、秦志扬。DB12/T 8432018 1 绿豆源成分检测 定性 PCR 法 1 范围 本标准规定了绿豆源成分的定性PCR检测方法的原理、试剂和材料、仪器、分析步骤、结果分析和表述、检出限。本标准适用于绿豆源成分的定性PCR检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 绿豆源成分特异性序列 specific sequence of Mung bean-derived ingredients 本标准绿豆源成分特异性序列位于绿豆第5号染色体。4 原理 根据绿豆源特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期的DNA片段，判断样品中是否含有绿豆源成分。5 试剂和材料 5.1 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。5.2 1 mol/L 氢氧化钠溶液：在 160 mL 水中加入 8.0 g 氢氧化钠（NaOH），溶解后，冷却至室温，再加水定容到 200 mL。5.3 CTAB-A buffer：将 4 g 十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、16.4 g 氯化钠（NaCl）、3.15 g 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）、1.5 g 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）依次加入到 100 mL 无菌去离子水中，用 1 mol/L 氢氧化钠溶液（见 5.1）调 pH 至 8.0，加水定容至 200 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 15 min。5.4 CTAB-B buffer：将 1 g 十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、0.5 g 氯化钠（NaCl）、依次加入到 100 mL 无菌去离子水中，用 1 mol/L 氢氧化钠溶液（见 5.1）调 pH 至 8.0，加水定容至 200 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 15 min。DB12/T 8432018 2 5.5 1.2 mmol/L NaCl 溶液：将 7 g 氯化钠（NaCl）溶于 100 mL 无菌去离子水中。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 15 min。5.6 70%乙醇：将 737 mL 95%乙醇，加水定容至 1000 mL。5.7 500 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（pH 8.0）：称取 18.6 g 乙二胺四乙酸二钠，加入 70 mL 水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液（见 5.1）直至 EDTA-Na2 完全溶解，用氢氧化钠溶液（见 5.1）调 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min。5.8 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）溶液（pH 8.0）：称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷溶解于 800 mL 水中，用盐酸调 pH 至 8.0，加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min。5.9 TE 缓冲液（pH 8.0）：分别量取 10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（见 5.7）和 2 mL 乙二胺四乙酸二钠溶液（见 5.6），加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121）条件下灭菌 20 min。5.10 琼脂糖。5.11 10 g/L 溴化乙锭（EB）溶液：称取 1.0 g 溴化乙锭，溶解于 100 mL 水中，避光保存。溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物。根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。5.12 50TAE 缓冲液：称取 242.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用 500 mL 水加热搅拌溶解后，加入 100 mL 乙二胺四乙酸二钠溶液（见 5.6），用冰乙酸调 pH 至 8.0，然后加水定容到 1 000 mL。使用时用水稀释成 1TAE。5.13 加样缓冲液：称取 250.0 mg 溴酚蓝，加入 10 mL 水，在室温下溶解 12 h；称取 250.0 mg 二甲基苯腈蓝，加 10 mL 水溶解；称取 50.0 g 蔗糖，加 30 mL 水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至 100 mL，在 4 下保存。5.14 DNA 分子量标准：可以清楚区分 100 bp1 000 bp 的 DNA 片段。5.15 dNTPs 混合溶液：将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。5.16 Taq DNA 聚合酶、PCR 扩增缓冲液及 25 mmol/L 氯化镁（MgCl2）溶液。5.17 绿豆源特异性引物：Mungbean_470bp_F：5-TGAATGAGAGTGGTGTGAGTGAGA-3；Mungbean_470bp_R：5-CCGCGAGTATTATTGATGGTAGG-3；预期扩增片段大小为 470 bp，参见附录 A。5.18 引物溶液：用 TE 缓冲液（见 5.8）或水分别将上述引物稀释到 10 mol/L。5.19 石蜡油。5.20 DNA 提取试剂盒。5.21 定性 PCR 试剂盒。5.22 PCR 产物回收试剂盒。6 仪器 6.1 分析天平：重感 0.1 g 和 0.1 mg。6.2 PCR 扩增仪：升降温速度 1.5/s，孔间温度差异 1.0。6.3 电泳槽、电泳仪等电泳装置。6.4 紫外透射仪。6.5 凝胶成像系统或照相系统。6.6 重蒸馏水发生器或超纯水仪。DB12/T 8432018 3 6.7 其他相关仪器和设备。7 分析步骤 7.1 DNA 提取 称取100 mg样品于2.0 mL离心管中，加入300 L无菌去离子水，充分混匀；加入500 L CTAB-A buffer，充分混匀；加入20 L蛋白酶K（20 mg/mL），充分混匀，65 水浴1 h，间期混匀三次；加入20 LRNase A（10 mg/mL），充分混匀，65 水浴10 min；16 000 g离心10 min；转移上清液至新的2.0 mL离心管中，加入500 L三氯甲烷，混匀30 s；16 000 g离心10 min；转移500 L上清液至新的2.0 mL离心管中，加入500 L 三氯甲烷，混匀30 s；16 000 g离心5 min，转移上清液至新的2.0 mL离心管中，加入2倍体积的CTAB-B buffer，吹打混匀，室温静置60 min；16 000 g离心5 min，弃上清液；沉淀中加入350 L 1.2 mmol/L NaCl，再加入350 L三氯甲烷，混匀30 s；16 000 g离心10 min，转移上清液至新的洁净2.0 mL离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀；16 000 g离心10 min，弃上清液；加入500 L 70%乙醇，颠倒混匀；16 000 g离心10 min，弃上清液；室温静置至管内水分完全蒸发，加入100 L无菌去离子水溶解沉淀，所得溶液即为绿豆DNA，-20 贮存备用。7.2 DNA 的浓度和质量 将DNA适当稀释或浓缩，使其OD260值在0.10.8的区间内，测定并记录其在260 nm和280 nm的吸光度。以1个OD260值相当于50 mg/L DNA浓度来计算纯化DNA的浓度，并进行DNA凝胶电泳检测DNA完整性。DNA溶液的OD260/OD280值应在1.72.0之间，或质量能复合检测要求。7.3 PCR 扩增 7.3.1 试样 PCR 反应 7.3.1.1 每一个试样 PCR 反应设置 3 次重复。7.3.1.2 在 PCR 反应管中按附录 B 依次加入反应试剂，混匀，再加 25 L 石蜡油（有热盖设备的 PCR仪可不加）。7.3.1.3 将 PCR 管放在离心机上，500 g3000 g 离心 10 s，然后取出 PCR 管，放入 PCR 仪中。7.3.1.4 进行 PCR 扩增。反应程序为：94 预变性 5 min；94 变性 30 s，58 退火 30s，72延伸 30 s，共进行 35 次循环，72 延伸 7 min。（可根据仪器和试剂要求对反应参数作适当调整。）7.3.1.5 反应结束后取出 PCR 管，对 PCR 产物进行电泳检测。7.3.2 对照 PCR 扩增 7.3.2.1 在试样 PCR 扩增的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。7.3.2.2 以绿豆材料提取的 DNA 作为阳性对照；以非绿豆材料 DNA 作为阴性对照；以水作为空白对照。7.3.2.3 除模板外，其余组分与 PCR 扩增与 7.2.1 相同。7.4 PCR 产物电泳检测 按20 g/L的质量浓度称取琼脂糖，加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液，每100 mL琼脂糖溶液中加入5 L EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固合成凝胶后，放入1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12 L PCR产物与3 L加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样空中加入DNA分子量标准，接通电源在2 V/cm5 V/cm条件下电泳检测。DB12/T 8432018 4 7.5 凝胶成像分析 电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文档存档或用照相系统拍照。如需通过序列分析确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照7.5和7.6的规定执行。7.6 PCR 产物回收 按PCR产物回收试剂盒说明书，回收PCR扩增的DNA片段。7.7 PCR 产物测序验证 将回收的PCR产物克隆测序，与绿豆源成分特异性序列（参见附录A）进行对比，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。8 结果分析和表述 8.1 PCR 扩增产物电泳检测结果 绿豆源成分的PCR扩增产物大小为470 bp，参见附录A。8.2 结果表述 在符合绿豆源成分的PCR产物大小为470 bp的情况下，被检样品进行检测时：PCR 扩增产物电泳检测结果阴性者判为不含绿豆源成分，表述为“未检出绿豆源成分”；PCR 扩增产物电泳检测结果阳性者判为含有绿豆源成分，表述为“检出绿豆源成分”。9 检出限 本标准方法的检出限为1%（含靶序列样品DNA/总样品DNA）。DB12/T 8432018 5 A A 附 录 A（资料性附录）绿豆源成分特异性序列 1 TGAATGAGAG TGGTGTGAGT GAGAATAACA ATCCAAGTGG CAGTCTTAAC TATGAACACA 61 GACAAGGAAG CAAAGTAGCA ATGATATAAA ATGTTCAGAA TCAAATTGCA GAATCCATTA 121 ATAAAATTTT GTAATGCAGA AGTAAGGAAA AAGTAATGTG TCCATAACAC TATCCTTGCG 181 CTCATACTAG CTCCCCAATT TGTTTGC