DB22T 2050-2014 动物源性饲料中猪源性成分测定 实时荧光PCR方法.pdf

ICS 65.120 B 46 备案号：41838-2014 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 20502014 动物源性饲料中猪源性成分测定 实时荧光 PCR 方法 Determination of porcine derived materials in animal-originated feedstuffs Real-time PCR method 2014-02-28 发布 2014-04-30 实施 吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20502014 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、华蕾、王潇、亓晓艳、王颖、冷喜芳、吴桐、陈颖。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20502014 1 动物源性饲料中猪源性成分测定 实时荧光 PCR 方法 1 范围 本标准规定了动物源性饲料中猪源性成分的实时荧光PCR检验方法，该方法的检出限为0.1%。本标准适用于动物源性饲料中猪源性成分的定性检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 猪源性成分 porcine-derived materials 猪种属特异性 DNA 片段。3.2 实时荧光PCR real time PCR 实时荧光聚合酶链式反应。3.3 Ct值 cycle threshold value 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 原理 对样品进行DNA提取，通过实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，检测饲料中猪源性成分。5 试剂 除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T 6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20502014 2 5.1 引物和探针 a)上游引物：5-CATGCGTATCACCACCATTATATC-3 b)下游引物：5-TGCCAAGCGGGTTGCT-3 c)探针：FAM-CGAGCTTAACTACCATGCCGCGTGA TAMRA 5.2 Taq DNA 聚合酶。5.3 dNTP：dATP（deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。5.4 动物基因组 DNA 提取纯化试剂盒。5.5 RNase A 酶：冻干品，不含 DNase。5.6 蛋白酶 K：冻干品。5.7 75%乙醇、异丙醇、三氯甲烷、异戊醇、正己烷等有机试剂。5.8 Tris 饱和苯酚。5.9 三羟甲基氨基甲烷（Tris）。5.10 三水合乙酸钠、氯化钠。5.11 十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide，CTAB）。5.12 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na22H2O）。5.13 10PCR 缓冲液：含 200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L氯化钾（KCl），15 mmol/L 氯化镁（MgCl2）。5.14 RNase A 酶溶液：用高压灭菌的去离子水溶解 RNase A 酶为 10 g/L 的溶液，分装后于-20 保存，避免反复冻融。5.15 蛋白酶 K 溶液：用高压灭菌的去离子水溶解蛋白酶 K 为 20 mg/mL 的溶液，分装后于-20 保存，避免反复冻融。5.16 乙酸钠溶液，3 mol/L：在 80 mL 水中，加入 40.81 g 三水合乙酸钠，溶解后用冰乙酸调节 pH 值到 5.2，用水定容到 100 mL，分装后高压灭菌。5.17 Tris-HCl，1 mol/L，pH8.0：在 800 mL 去离子水中溶解 121.1 g Tris，冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的 pH 值至 8.0，加水定容至 1 L，分装后高压灭菌。5.18 EDTA，0.5 mol/L，pH8.0：称取 186.1 g EDTA-Na22H2O，加入 700 mL 水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 10 mol/L 氢氧化钠调 pH 值至 8.0，用水定容到 1 L，分装后高压灭菌。5.19 CTAB 提取缓冲液 I：在 800 mL去离子水中加入 46.75 g 氯化钠，溶解后加入 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）50 mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 mL，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 10 mol/L 氢氧化钠调节溶液的 pH 值至 8.0，用水定容至 1 L，分装后高压灭菌。5.20 CTAB 提取缓冲液 II：在 800 mL去离子水中加入 46.75 g 氯化钠，20 g CTAB，完全溶解后加入1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）50mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 mL，用水定容至 1 L，分装后高压灭菌。5.21 Tris 饱和苯酚和三氯甲烷混合液，V(Tris 饱和苯酚)+V(三氯甲烷)=1+1。5.22 三氯甲烷和异戊醇混合液，V(三氯甲烷)+V(异戊醇)=24+1。5.23 TE 缓冲液（pH8.0）：在 800 mL 水中，依次加入 10 mL的 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）和 2 mL的 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），用水定容到 1 L，分装后高压灭菌。6 仪器和设备 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20502014 3 6.1 实时荧光 PCR 仪。6.2 生物安全柜。6.3 离心机：转速12000 r/min。6.4 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.5 高压灭菌器。6.6 恒温水浴锅。6.7 移液器：0.5 L10 L、10 L100 L、20 L200 L、200 L1 000 L。6.8 pH 计。6.9 振荡器。7 检测步骤 7.1 试样的预处理 50 g固体样品粉碎，颗粒大小在0.125 mm以下。7.2 DNA 提取和纯化 7.2.1 CTAB 法制备非油脂类饲料模板 DNA 称取100 mg粉碎后的样品于1.5 mL离心管中，加入300 L冰上预冷的CTAB提取缓冲液I，加入500 L于65 预热的CTAB提取缓冲液II，混匀，65 保温30 min90 min，期间不时轻缓颠倒混匀；加入5 L25 L蛋白酶K溶液，上下倒转混匀，37 水浴中保温1 h，中途每隔10 min左右倒转混合数次；待冷却至室温后加入5 L RNase A 溶液（10 mg/mL)，室温下放置30 min；室温12 000 r/min 离心10 min，取上清液，于另一干净的2 mL离心管中，分别用等体积Tris饱和苯酚、Tris饱和苯酚+三氯甲烷（1+1）和三氯甲烷+异戊醇（24+1）抽提三次，12 000 r/min 离心10 min；将上清液转移至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇及1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀；12 000 r/min 离心10 min，弃上清液，用500 L 75%乙醇洗涤沉淀两次；除去残留的乙醇，干燥后，DNA沉淀溶解于100 L TE缓冲液（预先加热至65 有利于溶解DNA）中，-20 保存备用。7.2.2 CTAB 法制备油脂类饲料模板 DNA 取油脂饲料适量（液态油取30 mL、磷脂类和固态油脂取5 g）放入250 mL三角瓶中，加入25 mL正己烷，于磁力搅拌器上不断振荡混合2 h后，加入25 mLCTAB提取缓冲液II，继续于磁力搅拌器上振荡混合2 h；将溶液转入100 mL离心管中，于8 000 r/min离心10 min，使有机相和水相分离，取下层水相，加入与下层水相溶液等体积的异丙醇及水相溶液1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀，室温放置10 min；12000 r/min 离心10 min，弃上清液，待沉淀干燥后用200 L TE缓冲液溶解沉淀，加入200 L Tris饱和苯酚+三氯甲烷（1+1），轻缓颠倒混匀溶液；12000 r/min 离心10 min，取上清液，加入与上清液等体积三氯甲烷+异戊醇（24+1），轻缓颠倒混匀，12000 r/min 离心2 min至分层；将上清液转移至干净的离心管中，加入与溶液等体积的异丙醇及溶液1/10体积的3 mol/L乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀；室温放置10 min后，12000 r/min 离心10 min，弃上清液后，依次加入800 L体积分数为75%的乙醇和100 L体积分数为75%的乙醇洗涤沉淀；12000 r/min 离心5 min，除乙醇溶液；待沉淀干燥后，DNA沉淀溶解于100 L TE缓冲液（预先加热至65 有利于溶解DNA）中，-20 保存备用。7.2.3 试剂盒法 采用商品化的动物源性基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明提取DNA。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20502014 4 注：DNA提取和纯化过程应用水作为核酸提取空白对照。7.3 DNA 浓度和纯度的测定 取10 L DNA溶液加蒸馏水稀释至1 mL，使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算，当A260/A280比值在1.52.1之间时，适宜于PCR扩增。扩增前将所有样品DNA调至10 ng/L50 ng/L。501000ANc=.(1)式中：c DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/L）；A 260 nm处的吸光值；N 核酸稀释倍数。7.4 实时荧光 PCR 检验 7.4.1 实时荧光 PCR 反应体系 实时荧光PCR反应体系见表1。每个样品设置2个平行。表1 实时荧光 PCR 反应体系 试 剂 加入量 L 10PCR 缓冲液 2.5 dNTP 溶液(10 mmol/L)1.0 Taq DNA聚合酶(5 U/L)0.2 上游引物(10 mol/L)1.0 下游引物(10 mol/L)1.0 探针（10 mol/L)）1.0 DNA 模板（10 ng/L50 ng/L)2.0 补水至 25 7.4.2 反应条件 95 预变性2 min，95 变性10 s，60 退火延伸1 min，同时收集FAM荧光，共进行40个循环，反应产物可在4 保存。不同仪器、不同Taq DNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。检测过程中设置PCR扩增空白对照、阴性对照和阳性对照。用已知含有猪