DB22T 1821-2013 粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的PCR检测.pdf

ICS 67.050 X 04 备案号：37940-2013 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 18212013 粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的 PCR 检测 Detection of trichothecenes-producing fungi in grains by PCR method 2013-05-15 发布 2013-09-01 实施吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 18212013 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位：吉林省产品质量监督检验院、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、华蕾、刘金华、王莹、李媛媛、初真林、王伟、刘静秋、周亮、王潇、刘晓晖、王颖、任明月。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 18212013 1 粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的 PCR 检测 1 范围 本标准规定了粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的PCR检验方法。本标准适用于粮食中产单端孢霉烯族化合物真菌的快速筛选。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.15 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用 3 原理 单端孢霉烯前体（trichodiene）合成酶是催化所有真菌单端孢霉烯族化合物合成反应第一步的酶类。根据该生化合成过程中的关键基因：单端孢霉烯前体合成酶编码基因tri5的有无来判断待检样品是否污染了产单端孢霉烯族化合物的真菌。4 试剂和材料 除特别说明以外，所用试剂为分析纯或生化试剂。4.1 水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。4.2 马铃薯-葡萄糖-琼脂（Potato dextrose agar，PDA）：按 GB 4789.15 规定。4.3 CTAB 缓冲液：55 mmol/L CTAB、1 400 mmol/L 氯化钠（NaCl）、20 mmol/L EDTA、100 mmol/L Tris，用 10%盐酸（HCl）调 pH 至 8.0，121 高压灭菌 20 min，储存于 2 8。4.4 TE 缓冲液：10 mmol/L Tris、150 mmol/L 氯化钠（NaCl）、2 mmol/L EDTA、1%十二烷基磺酸钠，用 10%盐酸（HCl）调 pH 至 8.0，121 高压灭菌 20 min，储存于 2 8 备用。4.5 RNA 酶溶液（5 g/L）。4.6 蛋白酶 K（20 mg/mL)。4.7 Tris 饱和酚。4.8 酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）；三氯甲烷：异戊醇（24：1）。4.9 异丙醇。4.10 70%乙醇。4.11 10PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L 氯化钾，15 mmol/L 氯化镁。4.12 引物 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 18212013 2 上游：5-GGGATGCTGGATTGAGCAG-3 下游：5-CATCACCTGAGGGTCCTTGT-3 4.13 Taq DNA 聚合酶。4.14 dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。4.15 分子量标记：100 bp DNA Marker。4.16 50TAE 电泳缓冲液：称取 484 g Tris，量取 114mL 冰醋酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA，溶于水中，定容至 2 L。分装后高压灭菌备用。使用前稀释成 1TAE 电泳缓冲液（工作液）。4.17 6加样缓冲液：30 mmol/L EDTA、36%（体积分数）甘油、0.05%（质量浓度）二甲苯腈蓝 FF、0.05%(质量浓度)溴酚蓝。4.18 琼脂糖：电泳纯。4.19 阳性质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的禾谷镰刀菌标准菌株。4.20 阴性质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的非目标菌株。5 仪器和设备 5.1 天平：感量 0.001 g。5.2 生物安全柜：AII 型。5.3 霉菌培养箱：28 1。5.4 高压灭菌器。5.5 恒温水浴锅：65 1。5.6 高速冷冻离心机：转速不低于 12 000 r/min。5.7 PCR 仪。5.8 核酸电泳仪。5.9 凝胶成像分析系统。5.10 紫外分光光度计。5.11 涡旋混合器 5.12 微量移液器：0.2 L2 L、2 L10 L、20 L200 L、100 L1 000 L。5.13 离心管：1.5 mL。6 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测真菌，所有培养物应小心处置。应按照GB 19489的规定执行。7 废弃物处理和防止污染的措施 7.1 检验过程中的废弃物需经 121 高压灭菌处理至少 30 min 后再弃置。7.2 检验过程中防止交叉污染的措施按 WS/T 230 执行。8 检测 8.1 样品制备与培养 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 18212013 3 参照GB 4789.15对样品进行稀释与培养。8.2 DNA 提取 8.2.1 DNA 模板制备 从培养平皿上刮取菌丝0.2 g0.5 g于1.5mL 离心管，加入少许石英砂用细玻璃棒充分碾碎菌丝，加入500 L CTAB、40 L蛋白酶K，震荡均匀，65 水浴30 min；加入500 L酚：三氯甲烷：异戊醇(25：241)，强烈震荡，12 000 r/min 离心15 min；吸取上层水相至1.5 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，震荡混匀，1 2000 r/min离心10 min；弃上清液，用预热至65 TE缓冲液溶解DNA（TE量视DNA沉淀的多少而定）；加入5 LRNA 酶溶液，37 水浴30 min；加入200 L三氯甲烷：异戊醇(241)，强烈震荡，12 000 r/min 离心15 min；吸取上层水相至新的1.5 mL 离心管中，加入等体积的异丙醇，震荡均匀，1 2000 r/min 离心10 min；弃上清液，加入1mL70%冰乙醇洗涤沉淀DNA，12 000 r/min 离心1 min；弃上清液，无菌条件下自然干燥，加预热至65 TE缓冲液溶解DNA。（如不能及时检验，可将提取液于-20 保存）。也可使用等效的真菌基因组DNA提取试剂盒。8.2.2 DNA 浓度测定 采用紫外分光光度法测定DNA，所测得OD值为核酸总量。紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是2 g/mL50 g/mL，值应该在0.051的区间内。将DNA溶液做适当的稀释，放入紫外分光光度计的比色皿中，于260 nm处测定其吸收值，1 OD260nm=50 g/mL双链DNA或38 g/mL单链DNA。PCR级DNA溶液的OD260nm/OD280nm比值为1.72.0。8.3 PCR 检测 8.3.1 空白对照、阴性对照和阳性对照试验 检验过程中分别设空白对照、阴性对照、阳性对照。空白对照设为以水代替DNA模板；阴性对照采用非目标菌的DNA作为PCR反应的模板；阳性对照采用禾谷镰刀菌DNA作为PCR反应的模板。8.3.2 反应体系 表1 PCR 反应体系反应体系 试 剂 加入量（L）10PCR buffer 2.5 dNTP 溶液(10 mmol/L)0.5 Taq DNA 聚合酶(5 U/L)0.2 上游引物(10 mol/L)1.0 下游引物(10 mol/L)1.0 DNA 模板（100 ng/L)2.0 补水至 25 8.3.3 PCR 扩增条件 94 预变性5 min，94 变性1 min，55 退火50 s，72 延伸1 min，34个循环，72 后延伸10 min，结束反应，4 保存。扩增片段长度：379 bp。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 18212013 4 不同仪器、不同Taq DNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。8.3.4 凝胶电泳检测 PCR 产物 用电泳缓冲液（1TAE）制备2%琼脂糖凝胶（55 60 时加入溴化乙锭至终浓度为0.5 g/mL，也可在电泳后进行染色）。取8 L15 L PCR扩增产物，分别和2 L上样缓冲液混合，进行点样，用DNA Ladder作参照。9 V/cm恒压电泳，电泳40 min60 min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。9 结果描述与判定 在阴性对照未出现条带，阳性对照出现预期379 bp的扩增条带条件下，如测试样品未出现379 bp的扩增条带，则表示样品中无产单端孢霉烯族化合物真菌核酸；如测试样品出现379 bp扩增条带则表示样品中存在产单端孢霉烯族化合物真菌核酸。_ 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印