DB13T 1115-2009 食品中军团菌的测定.pdf

ICSX1 667.100、竺T冫 pi DB13北省地方标准DB13/T 1115-2009食品中军团菌的测定Determination of Legionella bacteria in food2009-05-27发布2009-06-11实施河d匕省质量技术监督局发 布食品伙伴网http:/ 1115-2009月 i j 吕本 标 准 参 照 工 SO 11731-1998 军 团 菌 的 检 测 方 法（英 文 版）制 定。本 标 准 由 河 北 省 质 量 技 术 监 督 局 提 出 并 归 口。本 标 准 起 草 单 位：河 北 省 食 品 安 全 重 点 实 验 室、河 北 省 食 品 质 量 监 督 检 验 研 究 院。本 标 准 主 要 起 草 人：周 正、张 岩、周 巍、刘 辰 魁、康 素 芬、刘 东、穆 燕 魁。食品伙伴网http:/ 1115-2009食 品 中 军 团 菌 的 检 测 方 法范围本 标 准 规 定 了 食 品 中 军 团 菌 的 检 验 方 法。该 方 法 适 用 于 饮 用 水 中 军 团 菌 的 检 验。2术语和定义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准。3.1 军团菌Legionella 杆 形 菌，宽 度 0.3-0.9林 m，长 度 为 2-20 m以 上，不 形 成 内 孢 子 或 小 囊，无 英 膜，不 产 酸，革 兰 氏染 色 阴 性，借 一 两 根 或 以 上 直 的 或 弯 曲 的 极 鞭 毛 和 侧 鞭 毛 可 以 运 动，偶 尔 可 见 无 动 力 菌 株。需 氧，生 长时 需 L一 半 胱 氨 酸 和 铁 盐。氧 化 酶 阴 性 或 弱 阳 性，硝 酸 盐 还 原 试 验 阴 性，尿 素 酶 阴 性，液 化 明 胶。细 胞 壁中 有 支 链 脂 肪 酸。可 从 有 机 化 合 物 中 摄 取 营 养，可 利 用 氨 基 酸 作 为 能 量 来 源。不 发 酵 碳 水 化 合 物，亦 不能 使 之 氧 化。可 从 地 表 水、泥 土 和 热 水 及 污 染 的 湖 水 和 河 水 中 分 离 到 本 菌，但 从 土 壤 和 动 物 中 分 离 尚 不了 解，对 人 有 致 病 性，D NA 的 G+C m ol 含 量 为 39-43%(Tm Bd)3 试 剂3.1缓冲木炭酵母膏琼脂培养基（BCYE)3.2无 L一 半 胱 氨 酸 缓 冲 木 炭 酵 母 膏 培 养 基（BCYE-Cys)3.3选择性缓冲木炭酵母膏培养基（GVPC)4仪器4.1恒 温培 养 箱：36士 1 C o4.2天平：感量0.1g04.3无 菌 吸 头。4.4无菌试管。4.5无菌锥形瓶。5操作步骤5.1总 则：如 果 液 体 样 品 军 团 菌 的 数 量 估 计 超 过 105，可 以 采 用 直 接 平 板 法。为 了 确 保 低 于 这 个 数 量 样品 中 军 团 菌 的 检 测，需 采 用 浓 缩 技 术。为 了 浓 缩 水 样，可 采 用 膜 过 滤 法（(5.2)或 离 心 法（(5.3)5.2 膜 过 滤 法：如 果 样 品 是 浑 浊 的、乳 浊 的 或 有 颜 色 的，应 采 用 离 心 法。采 用 膜 过 滤 装 置 进 行 膜 过 滤，采 用 直 径 47-147 m m，孔 径 0.22 m 和 0.45m 的 膜。过 滤 后 的 膜 应 放 置 在 带 盖 的 无 菌 容 器 中，可用 无 菌 剪 刀 剪 碎，加 5 m L-2 5 m L 的 无 菌 稀 释 液 或 无 菌 去 离 子 水，不 断 摇 动 至 少 2 m in。也 可 将 容 器放入超声波中2-10 m in.食品伙伴网http:/ 1115-20095.3离 心 法：取 200 mL样 品 于 300 mL-500 mL容 积 的 离 心 瓶 中，6 000 g离 心 10 min或 3 000 g离 心 30 m in，保 持 温 度 在 巧 一 25 C，弃 去 上 清 液，将 沉 淀 物 悬 浮 在 2 m L-20 m L 无 菌 稀 释 液 或无 菌 去 离 子 水 中。5.4培养5.4.1将制备好的样品（浓缩的或未浓缩的）分成3份，1份不做任何处理；1份进行热处理；1份进行酸 处 理。5.4.2热 处 理：加 1 m L 士 0.5 m L 样 品 于 一 无 菌 容 器 中，50 士 1 水 浴 处 理 30 m in士 2 m ina5.4.3酸 处 理：加 1 mL-10 mL样 品 于 一 拧 盖 的 容 器 中，6 000 g离 心 10 min或 3 000 g离 心 30 min，用无 菌 枪 头 吸 去 一 半 体 积 的 上 清 液，通 过 涡 旋 重 新 悬 浮 剩 余 物，用 酸 处 理 缓 冲 液 补 足 原 始 体 积。混 合 静 置5 min士0.5 min.5.4.4选 择 性 培 养 基 的 接 种：分 别 接 种 未 处 理、热 处 理 和 酸 处 理 的 样 品 0.1 mL-0.5 ml于 GVPC培 养 基上，热 处 理 和 酸 处 理 的 样 品 应 在 处 理 完 立 即 接 种，记 录 接 种 体 积。5.4.5培养：翻转平板，36士1培养10 d.5.4.6检查平板 在 10d的 培 养 期 间，用 显 微 镜 在 2d-4 d内 至 少 观 察 3次（军 团 菌 生 长 较 慢，很 可 能 被 其 他 菌 掩 盖），记 录 每 一 种 菌 落 形 态 的 数 量。可 疑 军 团 菌 的 确 证 从 每 个 GVPC平 板 上 至 少 选 择 3个 可 疑 军 团 菌 菌 落 接 种 到 BCYE和 BCYE-Cys两 块 平 板 上 进 行 二 次 培养，3 6 士 1 培 养 至 少 2 d。在 B C Y E 上 生 长 而 在 B C Y E-C y s上 不 生 长 的 被 认 为 是 军 团 菌。通 过 血 清 学实 验 确 证 在 B C Y E 上 生 长 而 在 B C Y E-C y s 上 不 生 长 的 菌 落。注：血 琼 脂 和 营 养 琼 脂 可 以 代 替 B C Y E-C ys培 养 基食品伙伴网http:/