DB13T 1000-2008 乳及乳制品中三聚氰胺的测定.pdf

X 16 ICS 67.100 DB13河北省地方标准DB13/T 10002008乳及乳制品中三聚氰胺的测定 Determination of melamine in milk and dairy produce 2008-09-21 发布 2008-09-21 实施河北省质量技术监督局河北省质量技术监督局 发布 发布 DB13/T 10002008 I 前 言 本标准中附录A、附录B、附录C、附录D和附录E为规范性附录。本标准由河北省质量技术监督局提出。本标准第一法由河北省疾病预防控制中心负责起草。本标准第二法由河北省食品安全实验室、国家环保产品质量监督检验中心负责起草。本标准第三法由国家果类及农副加工产品质量监督检验中心（河北）负责起草。本标准第一法主要起草人：常凤启、秦振顺、董彬、杨娜静、路杨。本标准第二法主要起草人：乔炜、张岩、李挥、李玉国、范斌、张敬轩、陈瑞超、李兴、谢乐、赵一军、王丽霞、康素芬。本标准第三法主要起草人：谭立、张会军、王红、匡林鹤、李强、徐晓荣、夏静、何淑娟、张京、吴春敏、王军磊。DB13/T 10002008 2 乳及乳制品中三聚氰胺的测定 1 范围 本标准规定了乳及乳制品中三聚氰胺的测定方法。本标准适用于乳及乳制品中三聚氰胺的测定。本标准中高效液相色谱法定量检出限为 2.0 mg/kg；高效液相色谱-串联质谱法定量检出限为 0.01 mg/kg；气相色谱-质谱法定量检出限为 0.05 mg/kg。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 乳制品 是指以生鲜牛（羊）乳及其制品为主要原料，经加工而制成的各种食品。本标准所指的乳制品包括液体乳类（杀菌乳、灭菌乳、酸牛乳、配方乳）、乳粉类（全脂乳粉、脱脂乳粉、全脂加糖乳粉和调味乳粉、婴幼儿乳粉、其他配方乳粉）、含乳饮料类、炼乳类（全脂无糖炼乳、全脂加糖炼乳、调味炼乳；配方炼乳）、乳脂肪类（稀奶油、奶油、无水奶油）、干酪类（原干酪；再制干酪）、乳冰淇淋类（乳冰淇淋、乳冰）和其他乳制品类（干酪素、乳糖、乳清粉、浓缩乳清蛋白）等。第一法 高效液相色谱法 4 原理 试样经溶解、超声提取、沉淀蛋白、过滤得到测试液，经高效液相色谱测定，根据保留时间和紫外吸收光谱定性，根据峰面积进行定量。5 试剂 方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析纯试剂，水为GB/T 6682-2008中一级用水，溶液为水溶液。5.1 磺基水杨酸。5.2 柠檬酸。5.3 辛烷磺酸钠：高效液相色谱离子对试剂。5.4 乙腈：色谱纯。5.5 盐酸。5.6 60 g/L 磺基水杨酸：称取 60 g 磺基水杨酸用水定容至 1 L。DB13/T 10002008 3 5.7 0.1 mol/L 盐酸：量取 8.3 mL 盐酸用水稀释至 1 L。5.8 缓冲液：柠檬酸和辛烷磺酸钠浓度均为 10 mmol/L。5.9 三聚氰胺标准品：已知含量大于 99%。5.10 标准储备液：称取三聚氰胺标准品 0.01g（准确至 0.0 001g），用甲醇配制成浓度为 1 mg/mL 标准储备液。5.11 标准系列：将标准储备液用 0.1 mol/L 盐酸逐级稀释至 0.25g/mL，0.50g/mL，1.00 g/mL，2.00 g/mL，4.00 g/mL，5.00 g/mL，10.0 g/mL 的系列标准溶液。6 仪器 6.1 高效液相色谱，附二极管阵列检测器或紫外检测器。6.2 天平：感量0.01 g。6.3 分析天平：感量0.0 001 g。6.4 高速离心机：转速4 000 r/min。6.5 超声波清洗器。6.6 旋涡混匀器。7 样品处理 7.1 固态乳制品 称取 1.0 g 左右试样（准确至 0.0 001 g），加入 0.1 mol/L 盐酸约 15 mL，涡旋混匀，超声提取 30 min 后加入 60 g/L 磺基水杨酸 6 mL 8 mL，用 0.1 mol/L 盐酸定容至 25 mL，混匀后离心，上清液经0.45 m 的微孔滤膜过滤后进样。7.2 液态乳制品（包含酸奶）称取 15 g 左右试样（准确至 0.0 001 g），加入 60 g/L 磺基水杨酸 3 mL4 mL，用 0.1 mol/L 盐酸定容至 25 mL，混匀后离心，上清液经 0.45 m 的微孔滤膜过滤后进样。8 测定步骤 8.1 色谱条件 8.1.1 色谱柱：ODS C8，250 mm4.6 mm，5 m。8.1.2 流动相：缓冲液乙腈=8515。8.1.3 流速：1.0 mL/min。8.1.4 柱温：40。8.1.5 波长：240 nm。上述色谱条件是典型的，可根据实际情况做具体调整。8.2 测定 8.2.1 标准曲线制备 将标准系列 0.25g/mL，0.50g/mL，1.00 g/mL，2.00 g/mL，4.00 g/mL，5.00 g/mL，10.0 g/mL 分别进样 20 L,以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作图，制作标准曲线。8.2.2 样品测定 取制备好的试样溶液进样 20 L,进行液相色谱分析。根据保留时间和紫外吸收光谱定性，根据峰面积进行定量。三聚氰胺的标准色谱图和光谱图见图 1 和图 2。DB13/T 10002008 4 AU-0.020.000.020.040.060.080.100.120.140.160.18?2.004.006.008.0010.0012.0014.0016.00sjqan-13.084au0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.60?220.00240.00260.00280.00300.00320.00340.00360.00380.00235.9 图 1 标准色谱图 图 2 三聚氰胺光谱图 9 结果计算 9.1 试样中三聚氰胺的含量（mg/kg）按式（1）计算:（1）m 的含量，g/mL；果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。9.2 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10。第二法 高效液相色谱-串联质谱法 10 原理 超声提取、MCX固相萃取柱净化，高效液相色谱仪（配硅胶色谱柱分11 试剂 法中所用试剂，除另有规定外，均为分析纯试剂，水为GB/T 6682-2008中一级用水，溶液为水溶 计算 CV X=式中：X样品中三聚氰胺含量，mg/kg；C从标准曲线上查出 V定容体积，mL m称样量，g。平行测定结精密度 试样中三聚氰胺经乙腈水溶液离）、串联质谱定性定量分析。方液。11.1 甲醇。DB13/T 10002008 5 加水至1 000 mL。00 mL甲醇中。的三聚氰胺标准品，用乙腈水溶液（7，用乙腈水溶液（28）定溶至刻度，该标准工作液浓度分别为10 g/mL和100 g/mL，现用现配。仪：配有电喷雾离子源（ESI）。15 000 r/min）。12.9 Oasis MCX固相萃取柱：150 mg/6 mL，或相当者。13 样品处理 13.1盐酸溶液（11.5），提取液定容至刻度，超声提取20 min，10 000 r/min低温离心5 min，13.1液（11.5），提取液定容至刻度，超声提取20 min，10 000 r/min低温离心5 min，上清液待净液（11.5），提取液定容至刻度，超声提取20 min，10 000 r/min低温清液待净化。13.2min，上清液过0.22 m滤膜，供高效液相色谱-串联质谱法测定。线的制备 11.2 乙腈：色谱纯。11.3 盐酸：优级纯。11.4 甲酸铵：优级纯。11.5 1 mol/L盐酸水溶液：量取90 mL盐酸，11.6 0.02 mol/L甲酸铵水溶液：pH=5.0。11.7 氨水甲醇溶液：量取5 mL氨水溶解至111.8 三聚氰胺标准品：已知含量99。11.9 三聚氰胺标准贮备液：准确称量100 mg(精确至0.1 mg)3）溶解定容于100 mL容量瓶，该溶液浓度为1 000g/mL。11.10 三聚氰胺标准工作液：分别准确量取三聚氰胺标准贮备液（11.9）1.0 mL和10.0 mL于100 mL容量瓶中12 仪器 12.1 高效液相色谱-串联质谱12.2 天平：感量0.01 g。12.3 分析天平：感量0.00 001 g。12.4 高速低温离心机（12.5 超声波振荡仪。12.6 旋涡混匀器12.7 氮吹仪。12.8 固相萃取装置。13.1 提取步骤.1 固态乳制品 准确称取样品2 g（精确至0.01 g）于50 mL具塞刻度离心管中，分别加入25 mL乙腈水（6040）混合提取液和1 mL上清液待净化。.2 液态乳制品 准确称取样品10 g（精确至0.01 g）于50 mL具塞刻度离心管中，分别加入25 mL乙腈提取液和1 ml盐酸溶化。13.1.3 酸奶 准确称取样品10 g（精确至0.01 g）于50 mL具塞刻度离心管中，分别加入25 mL乙腈水（8020）混合提取液和1 mL盐酸溶离心5 min，上 净化 依次加入3 mL甲醇、3 mL水活化固相萃取柱，准确移取10.0 mL上清液（13.1）过固相萃取柱，控制过柱速度在1 mL/min以内。再依次加入3 mL水和3 mL甲醇淋洗固相萃取柱，抽近干，用8 mL氨水甲醇溶液（11.7）洗脱，收集洗脱液于50氮气吹干，用20乙腈水溶液1.0 mL溶解残渣，漩涡混匀1 min，10 000r/min低温离心5 13.3 空白添加标准曲DB13/T 10002008 6 13.3的各系列空骤操作，供高效液相色谱-串联质谱测定，制作标准曲线。13.3的各系列空添加试样，按13.113.2步骤操作，供高效液相色谱-串联质谱测定，制作标准曲线。梯度洗脱条件见附录A。in。10 L。8,碰撞池电压为35 V。条件见附录B。14.3范围之内，在上述色谱条件下，样溶液中的特征离子的质量色谱图见附录C。量 14.3离子丰度的最大允许偏差不超过10%，同时则可判断样品中存在相应的被测物。14.3将供试试样和标准溶液的定量离子面积之比作单点校正。15 结果计算 15.1试样中三聚氰胺的含量（mg/kg）按式（2）计算:.1 固态乳制品 分别准确量取10.0 g/mL三聚氰胺标准工作液（11.10）适量，添加到2.0 g（精确至0.01 g）空白试样中，制得浓度为0.50 mg/kg、2.00 mg/kg、5.00 mg/kg、8.00 mg/kg、10.00 mg/kg白添加试样，按13.113.2步.2 液态乳制品和酸奶 分别准确量取100.0 g/mL三聚氰胺标准工作液（11.10）适量，添加到10 g（精确至0.01 g）空白试样中，制得浓度为0.50 mg/kg、2.00 mg/kg、5.00 mg/kg、8.00 mg/kg、10.00 mg/kg白 14 测定步骤 14.1 色谱条件 14.1.1 色谱柱：Hypersil SiO2 硅胶色谱柱，250 mm4.6 mm，5 m，或相当者。14.1.2 流动相：A相:乙腈，B相:甲酸铵水溶液（5.6）。14.1.3 流速：0.8 mL/m14.1.4 柱温：40。14.1.5 进样量：14.2 质谱条件 14.2.1 定量离子对为 127/85,碰撞池电压为 20 V。14.2.2 定性离子对为 127/614.2.3 其他14.3 测定.1 测定法 取试样溶液和相应的空白添加标准溶液，单点校准，外标法计算，即得。以峰面积积分值定量，空白添加标准溶液及试样溶液中三聚氰胺的响应值均应在仪器检测的线性空白添加标准溶液和试14.3.2 定性与定.2.1 定性 通过样