DB13T 1095-2009 饲料用酶制剂中α-淀粉酶活力的测定 分光光度法.pdf

I C S 6 5.1 2 0B 4 6DB1 3河 北 省 地 方 标准DB1 3/T 1 0 9 5-2 0 0 9饲料用酶制剂中a 一 淀粉酶活力的测定 分光光度法2 0 0 9-0 6-1 7发布2 0 0 9-0 7-0 2实施河 北 省 质 量 技 术 1 1/.督 局 发布D B 1 3/T 1 0 9 5-2 0 0 9前吉.二 刁本标准由河北省畜牧兽医局提出。本标准起草单位:河北省饲料产品质量监督检验站、河北农业大学、河北省畜牧站。本标准主要起草人:武英利、王萍、赵国先、李海龙、霍韶瑜、李广东。DB1 3/T 1 0 9 5-2 0 0 9 饲料用酶制剂中a 一淀粉酶活力的测定 分光光度法，范围 本标准规定了饲料用酶制剂中。一 淀粉酶活力的单位定义和测定方法。本标准适用于饲料用酶制剂中。一 淀粉酶活力的测定。6 4 规范性引用文件 下列文件通过本标准的引用而成为本标准的 条款。凡是注明日 期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内 容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的 最新版本。凡是不注明日 期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 6 6 8 2-2 0 0 8 分析实验室用水规格和试验方法 Q B/T 1 8 0 3-1 9 9 3 工业酶制剂通用试验方法3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1a 一 淀粉酶活力单位在6 0 9C,p H=6.0 的条件下，l h 液化l g 可溶性淀粉所需的酶的 量，规定为一个酶活力单位。4 原 理 。一 淀粉酶能将淀粉分子链中的a-1,4葡萄糖昔键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活性有关故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。仪器和设备5.1 分析天平，感量为0.0 0 01 9 05.2 研钵。5.3 容量瓶，5 0 m L,1 0 0 m L o5.4 电炉，温度可调。5.5 恒温水浴锅，温控范围3 0 土 0.1 9 C -6 0 9 C 1 0.1 5.6 烧杯，2 5 0 m L,5 0 0 m L o5.7 酸度计，精度0.0 1。5.8 秒表。5.9 离心机，6 0 0 0 r/m i n (2 4 0 0 X g)5.1 0 移液器，精度1 0 L L o5.1 1 分光光度计。5.1 2 比色管，2 5 m L o6 试 剂DB1 3/T 1 0 9 5-2 0 0 9 方法中 所用试剂，除另有规定外均为分析纯试剂，所用水应符合G B/T 6 6 8 2-2 0 0 8 三级以 上用水要求。6.1 碘。6.2 可溶性淀粉。6.3 磷酸氢二钠(N a 2 H P O 4.1 2 H 2 0)o6.4 柠檬酸(C 6 H 8 0 7 H 2 O)o7 溶液7.1 浓碘液 称取碘1 1 g、碘化钾2 2 g，用少量水使完全溶解，然后用水定容至5 0 0 m L,贮存于棕色瓶中。7.2 工作用碘液 吸取浓碘液2.0 0 m L，加碘化钾2 0 g，用水溶解并定容至5 0 0 m L，贮存于棕色瓶中，现用现配。7.3 可溶性淀粉溶液，浓度2 0 叭 称取1 0 5 土 2 干燥至恒重的可溶性淀粉2.0 0 0 g(精确至0.0 0 1 g)，用少量水调成稀糊状，在搅动状态下缓缓加入7 0 m L 沸水，继续煮沸至溶液透明，冷却，转移并定容至1 0 0 m L，此液现用现配。7.4 磷酸缓冲溶液，p H 6.0 称 取磷酸 氢 二钠4 5.2 3 g、柠 檬酸8.0 7 g，用水 溶解 定容 至1 0 0 0 m L，调p H 6.08 试样的选取和制备 选取具有代表性的试样用四分法缩减至2 0 0 g，粉碎至0.2 5 m m，装人密封容器中，备用。9 分析步骤9.1 待测酶液的制备9.1.1 称取试 样1 2 g(精确至0.0 0 0 2 g)置研钵中，加少量磷酸缓冲 溶液湿润，研磨3 分钟，加1 5 m L磷酸缓冲溶液，混匀，静置，将上层清液倾人1 0 0 m L 容量瓶中。9.1.2 沉渣部分继续研磨3 分钟，加1 0 m L 磷酸缓冲溶液，混匀，静置，将上层清液倾人容量瓶中。9.1.3 重复9.1.2 操作至少3 次，将试样全部转移至容量瓶中，用磷酸缓冲溶液定容至刻度，摇匀。9.1.4 量 取9.1.3 混悬 溶液2 0 m L,6 0 0 0 r/m i n (2 4 0 0 X g)离心1 0 m i n，吸取 上清液适 量，用 磷酸 缓冲液稀释至酶活力3.7 U/m L-5.6 U/m L 供试验用。9.2 测定9.2.1 准确量取淀粉溶液2 0.0 0 m L 置于2 5 m L比色管中，准确加入磷酸缓冲溶液5.0 0 m L，于温度6 0 jC、振摇速度 1 0 0/分钟的水浴摇床中预热 1 0 m i n d9.2.2 准确量取预先在温度6 0 C C、振摇速度 1 0 0/分钟的水浴摇床中预热 1 0 m i n 的稀释酶液(9.1.4)1.0 0 m L加人9.2.1比色管中，置温度6 0 9 0、振摇速度 1 0 0/分钟的水浴摇床中反应5 m i n(准确计时)。9.2.3 反应结束后立即准确量取反应液(9.2.2)1.0 0 m L 加人装有 5.0 0 m L 工作用碘液的2 5 m L 比色管中，摇匀，作为样品测试溶液。9.2.4 以工作用碘液为空白 对照，在“O n m波长处测定样品测试溶液的吸光度，根据测得的 试样吸光度在Q B/T 1 8 0 3-9 3 附录A中 查出 对应的酶液浓度。9.3 结果计算与表述9.3.1 结果计算 a 一 淀粉酶活力按(1)式进行计算:X二C x V(1)D B1 3/T 1 0 9 5-2 0 0 9 式中:X 一 一酶活力，U/g o G 一 一 从表中查出的试样溶液的酶活力，U/m L;V试样稀释总体积，m L;M试样质量，g 09.3.2 结果表述 每个样品应取2 份平行样进行测定，以其算术平均值为分析结果，结果保留整数。1 0 重复性 两平行测定结果的允许相对偏差不大于3.0%.