DB13T 1080-2009 乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定.pdf

ICS67.100X 16DB13?可北省地方标准DB13fT1080-2009乳及乳制品中-内酷股酶的测定Detection ofJ3-lactamases in milk and milk products2009-05-27发布2009-06-11实施河北省质量技术监督局发布食品伙伴网http:/食品伙伴网http:/DB13fT1080-2009.a.L.目U昌本标准的附录A和附录C为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由河北省质量技术监督局提出并归口。本标准第一法由河北省食品质量监督检验研究院起草。本标准第二法由河北省食品质量监督检验研究院起草。本标准第三法由河北省科学院生物所起草。本标准第一法主要起草人:周正、周巍、李丛芬、穆燕魁、张岩。本标准第二法主要起草人:李挥、张敬轩、庞坤、范斌、张岩。本标准第三法主要起草人:闰静辉、陈英珠、吴萌、程华、李春生、张小兵、董超、李亚瑛。食品伙伴网http:/食品伙伴网http:/DB13/T1080一2009乳及乳制品中卡内酷股酶的测定第一法杯碟法1范围本标准规定了乳及乳制品中。一内酷胶酶的检验方法-杯碟法。本标准适用于生鲜乳、巴氏杀菌乳及灭菌乳中具有活性且对舒巴坦敏感的自-内酷胶酶的检验。本方法的检出限为4U1rnL。2原理该方法采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，利用舒巴坦特异性抑制自-内酷胶酶的活性，并以青霉素作为指示物，通过比对加入自-内酷胶酶抑制剂与未加入抑制剂的样品所产生的抑菌圈的大小米间接测定样品中的日-内航胶酶。3设备和材料3.1抑菌圈测量仪或测量尺。3.2恒温培养箱:36C1c。3.3高压灭菌器。3.4元菌培养皿:内径90mm，具陶瓦盖。3.5元菌牛津杯:外径(8.00.1)mm,内径(6.0士0.1)mm，高度(10.00.l)mm。3.6麦氏比浊仪或标准比浊管。3.7无菌吸管:1mL(0.01mL刻度值)，10mL(0.1mL刻度值)。3.8加样器:5L20L，20L200L及配套吸头。4培养基和试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯，71为CBII6682中规定的三级水。4.1试验菌种:藤黄微球菌(Micrococcusluteus,CMCC(B)28001)，使用菌株代数3-14代。4.2磷酸盐缓冲榕液:按附录A中A.1规定。4.3生理盐水(8.5giL):按附录A中A.2规定。4.4青霉素标准洛液:按附录A中A.3规定。4.5-内毗胶酶标准榕液:按附录A中A.4规定。4.6舒巴坦标准溶液按附录A中A.S规定。4.7营养琼脂培养基:按附录A中A.6规定。4.8抗生素检测用培养基IT:按附录A中A.7规定。4.9空白牛奶:按附录A中A.8规定5操作步骤5.1菌悬液的制备将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经361c培养18h22h，用无菌生理盐水洗下菌苔即为食品伙伴网http:/DB13fT1080-2009菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度应大于1X 1010CFU/mL,4C保存，贮存期限2周。5.2样品的制备将待检样品充分混匀，取1mL待检样品于1.5mL离心管中共4管，分别标为:A、B、C、D，每个样品做三个平行。5.3对照的制备5.3.1阴性对照，每次检验应取空白牛奶1mL加入到1.5mL离心管中共四管，分别标为:A、B、C、D，每次实验均做三个平行作为对照。5.3.2阳性对照，取空白牛奶1mL加入到1.5mL离心管中，加入。-内酷胶酶标准榕液25L，共做四管，分别标为A，B,C、D，每次实验均做三个平行作为对照。5.4检验用平板的制备取90mm灭菌培养皿底层加10mL灭菌的抗生素检测用培养基E凝固后上层加入5mL含有浓度为1XI08CFU/mL藤黄微球菌的抗生素检测用培养基E每个检验用平板上均匀放置4个无菌牛津杯。5.5样品的测定按照下列顺序分别将青霉素标准榕被、自-内酷胶酶标准榕液、舒巴坦标准揭穿液加入到5.2各离心管中:A青霉素5L。B舒巴坦25L、青霉素5L。C-内酷胶酶25L(终浓度4U!mL)、青霉素5L。D-内酷胶酶25L(终浓度4U/mL)、舒巴坦25L、青霉素5L。将上述AD试样混匀后各取200L加入放置于检验用平板上的4个无菌牛津杯中，36土IC培养1822h，测量抑菌圈直径。取主组平行试验平均值。6结果观察各平行试验结果差异应小于2.0mm;阴性对照与阳性对照结果应符合表1实验现象，则可进行结果报告。表1实验现象对应表阴性对照阳性对照A抑菌圈直径应在20土2.0rom范围内B、D均产生抑菌圈B、D均产生抑菌圃C抑菌圈与D抑菌圃差异大于等于3.0romC抑菌圈与D抑菌圈差异大于等于3.0romA抑菌圈与B抑菌圈差异小于3.0mmA抑菌圈与B抑菌阁差异大于等于3.0rom7结果报告7.1样品结果同阳性对照结果实验现象一致可判定检验结果阳性。7.2如样品结果同阴性对照结果现象一致可判定检验结果阴性。2食品伙伴网http:/DB13fT1080-2009第二法高效液相色谱一质谱/质谱法1范围本标准规定了乳及乳制品中具有活性的自-内酷胶酶的高效液相色谱-串联质谱的定性检测方法。本标准适用于生鲜乳、巳氏杀菌乳及灭菌乳中具有活性的。-内酷胶酶的定性检验。本方法对自-内酷胶酶的检测低限为4UlmL。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBff 6682分析实验室用水规格和实验方法(GB厅6682-2008，ISO3696:1987,MOD)。3原理利用自-内酷胶酶酶解青霉素族药物的原理，在试样中加入一定量氨节青霉素，酶解后，试样中氨节青霉素经乙腊-水榕液提取，提取液浓缩后，用缓冲榕液溶解，固相萃取净化，浓缩，液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量，通过试样中氨节青霉素酶解率，间接定性。-内酷胶酶。4试剂除另有说明外，所有试剂均为分析纯，水为GBff6682规定的一级水。4.1乙睛:高效液相色谱级。4.2甲醇:高效液相色谱级。4.3甲酸:高效液相色谱级。4.4氯化销。4.5氢氧化锅。4.6磷酸二氢饵。4.7磷酸氢二饵。4.80.1moLnl氢氧化铀:称取4g氢氧化锅，并用水稀释至1000mL。4.9乙睛+水(15+2，体积比)。4.10乙睛+水(30+70，体积比)。4.110.05moLnl磷酸盐缓冲榕液(pH=7.0):称取3.4g磷酸二氢饵，超纯水溶解，稀释至1000mL,用氢氧化铀调节pH至7.0O.l。4.120.01moUL乙酸镀榕液(pH=4.5):称取0.77g乙酸钱，超纯水榕解，稀释至1000mL，用甲酸调节pH=4.5 土0.1。4.13氨节青霉素标准品:纯度大于等于959忘。4.14标准储备榕液(100g/mL):称取适量标准品(4.14)，用超纯水溶解并定容至10mL，置于-18t:冰箱避光保存，保存期5d。4.15标准工作榕液:吸取适量的氨书青霉素标准储备液(4.15)，用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质标准工作溶液，用时现配。4.16OasisHLB固相萃取小柱，或相当者:500mg,6mL，使用前用甲醇和水预处理，即先用2mL甲醇淋洗小柱，然后用1mL7.l5020-5010-20主主10允许的最大偏差士20士25士30士507.5.3.2定量测定用氨节青霉素标准储备溶液配成的基质标准溶液(4.16)进样分析，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，标准曲线的相关系数要求不小于0.995。根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行单点校准，外标法计算。7.5.4本底实验除不加氨节青霉素外，均按上述操作步骤进行。8结果计算与表述8.1试样中氨节青霉素含量的计算试样中氨书青霉素的含量(趴cg或问):按式(1)计算AxCsxVx=.(l)AsxW式中:X一一试样中氨节青霉素的含量，单位为微克每千克或微克每升(g!kg或/-Lg!L);A一一试样溶液中氨节青霉素的峰丽积;AS-标准工作液中氨书青霉素的峰面积;cs-标准工作液中氨书青霉素的浓度，单位为微克每千克或微克每升(/-Lg!kg或/-Lg!L);V一一试液最终定容体积，单位为毫升(mL);w-一最终样液代表的试样质量，单位为克(g)。计算结果以平行测定值的算术平均值表示，保留3位有效数字。汁算结呆需折算回收率。5食品伙伴网http:/DB13/T1080-20098.2重复性在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8.3回收率本方法在试样中添加0.5mglkg2mglkg浓度时回收率为80%110%。9定性判定9.1氢韦青葛素的酶解率酶解后试样中氨节青霉素的酶解率(%):按式(2)计算Cn-(C-C.)y=o,-sx100.(2)G式中:Y一一酶解后试样中氨书青霉素的酶解率，单位为百分比(%);C。一一酶解前试样中氨苇青霉素的加入浓度，单位为微克每千克或微克每升(glkg或gIL);C一一酶解后试样中氨书青霉素的含量，单位为微克每千克或徽克每升(glkg或gIL);Cs-酶解后试样本底中氨书青霉素的含量，单位为微克每千克或微克每升(趴(g或gIL)。9.2结果判定酶解率;:=30%，则判定为阳性。酶解率30%，则判定为阴性。6食品伙伴网http:/DB13fT1080-2009第三法确量法1范围本标准规定了鲜乳中卡内酷胶酶的快速腆量法检测方法。本标准适用于鲜乳中自-内酷胶酶的测定。本方法对卡内酷胶酶的检测低限为5UlmL。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBff6682分析实验室用水规格和实验方法(GB厅6682-2008，ISO3696:1987,MOD)。3原理自-内眈胶酶能裂解青霉素的-内酷胶环形成青霉唾瞠酸，它与淀粉竞争游离腆，破坏了础和淀粉的兰色复合物，使兰色变为白色。如果牛奶中的卡内酷腊酶浓度高于检测限，检测结果为白色。4试荆除另有说明外，所有试剂均为分析纯，zj(为GBff6682规定的一级水。4.1可溶性淀粉:按附录C中C.l规定。4.2腆:按附录C中C.2规定。4.3腆化饵:按附录C中C.3规定。4.4盐酸:按附录C中C.4规定。4.5青霉素铀:按附录C中C.5规定。4.6日-内酷胶酶对照品:按附录C中C.6规定。4.7不含-内酷胶酶的乳品:按附录C中C.7规定。5仪器5.1冷冻干燥机。5.2恒温干燥箱:40C。5.3微量振荡器。5.4分析天平:精度0.001g。5.5微波炉。5.6移液器:10L、40L、150L。5.7冰箱。5.8微孔板。6试样制备与保存取代表性样品，混匀后，装人洁净容器中，密封，并标明标记，于04C冷藏短期存放。7对照制备7.1取阳性对照，用移液器注入500L水，振荡，充分榕解备用;7.2取阴性对照:用移液器注入500L水，振荡，充分榕解备用;7食品伙伴网http:/DB13fT1080-20098测定8.1根据检测样品数量取适量的检测孔，每孔检测一个样;8.2取阳性对照150L加入1个小孔中;8.3取阴性对照150L加入1个小孔中;8.4样品处理:取奶样，去除悬浮物，用微量移液器吸取奶样150L分别加入到检测孔中;8.5所有样品加完后，贴封口膜，置微量振荡器上振荡10分钟;8.6放入40C恒温箱中，保温20分钟;8.7取出检测孔，除去封口膜，用微量移液器吸取1%的淀粉溶液，每孔加入40L，振荡棍匀;8.8用微量移液器吸取腆液，每孔40L，用移液器吹吸均匀;8.9振荡2分钟，观察结果。9检测注意事项混匀要彻底，但不要产生泡沫，严禁将样品溅出。10结果判定白色为阳性。蓝色为阴