细胞破碎蛋白质复性和固液分离.ppt

第二篇第二篇 目标产品的分离与纯化目标产品的分离与纯化 第五章第五章 细胞破碎、蛋白质复性和固液分离细胞破碎、蛋白质复性和固液分离 细胞破碎细胞破碎 固液分离固液分离 初级分离初级分离(粗粗)纯化精制纯化精制 下游技术基本过程下游技术基本过程 下游加工技术的重要性下游加工技术的重要性 1.1.产品分离纯化是最终获得商业产品分离纯化是最终获得商业产品的环节。产品的环节。2.2.投资费用高（抗生素、乙醇、投资费用高（抗生素、乙醇、柠檬酸占柠檬酸占60%60%）。）。3.3.分离纯化技术落后会阻碍发酵分离纯化技术落后会阻碍发酵工程技术的发展。工程技术的发展。几种产品在发酵液中的浓度几种产品在发酵液中的浓度 产品产品 典型浓度（典型浓度（g/Lg/L）抗生素抗生素 2525 氨基酸氨基酸 100100 酒精酒精 100100 有机酸有机酸 100100 酶酶 2020 蛋白质蛋白质 1010 下游加工技术的特点下游加工技术的特点 1.1.发酵液的复杂性造成分离上的困难性。发酵液的复杂性造成分离上的困难性。2.2.欲提取的产物通常浓度低且很不稳定。欲提取的产物通常浓度低且很不稳定。3.3.多为分批操作，各批发酵液不尽相同，多为分批操作，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定弹性。要求下游加工有一定弹性。产物提纯过程的不同决定于：产物提纯过程的不同决定于：对象材料、目标产物特性及对对象材料、目标产物特性及对其纯度的要求其纯度的要求 第一节第一节 概述概述 基因工程生物制品分离纯化基因工程生物制品分离纯化:工程菌经过大规模培养后，工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高杂质含量却很高 分离纯化分离纯化极其重要极其重要 基因工程药物从转化细基因工程药物从转化细胞、生产，对产品的纯胞、生产，对产品的纯度要求高于传统产品。度要求高于传统产品。发酵液发酵液 细胞分离细胞分离 胞内产物胞内产物 胞外产物胞外产物 细胞破碎细胞破碎 固液分离固液分离 包涵体包涵体 细胞碎片分离细胞碎片分离 变性变性 复性复性 浓缩浓缩 初步分离初步分离 高度纯化高度纯化 制剂制剂 产品产品 基因工程制品分离纯化的一般流程基因工程制品分离纯化的一般流程 初级分离初级分离：分离细胞和培养液，破碎细分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解包含体（包涵体），复胞释放产物，溶解包含体（包涵体），复原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质等原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质等过程。过程。主要决定产物的得率主要决定产物的得率。纯化精制纯化精制：初级分离基础上，用各种高初级分离基础上，用各种高选择性手段，主要是各种层析技术，将目选择性手段，主要是各种层析技术，将目标产物和干扰杂质尽可能分开，使产物的标产物和干扰杂质尽可能分开，使产物的纯度达到有关要求。纯度达到有关要求。主要决定产物的纯度主要决定产物的纯度。产物提纯过程包括两个基本阶段：产物提纯过程包括两个基本阶段：第二节第二节 细胞破碎细胞破碎 目的：目的：释放细胞内含物释放细胞内含物。分类：分类：按照是否存在外加作用力分按照是否存在外加作用力分为机械法和非机械法。为机械法和非机械法。问题：问题：破碎率是否越高越好？破碎率是否越高越好？以大肠杆菌为以大肠杆菌为宿主药物多为宿主药物多为胞内产物胞内产物 破碎方式破碎方式 机械法机械法 固体剪切作用固体剪切作用 珠磨法珠磨法 压榨压榨 液体剪切作用液体剪切作用 高压匀浆高压匀浆 超声破碎超声破碎 非机械法非机械法 干燥处理干燥处理 溶胞作用溶胞作用 酶溶法酶溶法 化学法化学法 物理法物理法 细胞破碎方法分类图细胞破碎方法分类图 1 1、高压匀浆法、高压匀浆法 组成组成：高压泵和匀浆阀高压泵和匀浆阀 作用机理作用机理：高压泵将电机的旋转运动转变高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变形，从而达到破碎细胞的目的形，从而达到破碎细胞的目的。高压匀浆阀结构示意图高压匀浆阀结构示意图 进液口进液口 出液口出液口 阀座阀座 碰撞环碰撞环 阀杆阀杆 高压匀浆器高压匀浆器 19.6-25.4MPa 适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎 高压匀浆法动力学方程高压匀浆法动力学方程 破碎效率与匀浆阀结构、操作压力和破碎次数有关：破碎效率与匀浆阀结构、操作压力和破碎次数有关：LnLn(R Rm m/(/(R Rm m-R)=R)=KNPKNPa a R R：单位生物量释放出的产物量（：单位生物量释放出的产物量（mg/G)mg/G)R Rm m：R R的最大值；的最大值；K K：破碎速率常数；：破碎速率常数；N N：破碎次数；：破碎次数；P P：操作压力；：操作压力；a:a:与微生物性质有关的指数系数。与微生物性质有关的指数系数。破碎率破碎率-操作压力操作压力-温度控制温度控制-能耗能耗 温度对活性物质的失活作用温度对活性物质的失活作用 提高压力需增加能耗：提高压力需增加能耗：3.5KW/100MPa3.5KW/100MPa 移走热量需付出代价：移走热量需付出代价：23.8/100MPa23.8/100MPa 高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却 匀浆过程中产生的热匀浆过程中产生的热蛋白质和酶的失活蛋白质和酶的失活 温控和能耗温控和能耗 堵塞（不适合团块状或丝状真菌），质地堵塞（不适合团块状或丝状真菌），质地坚硬者如包含体易损伤匀浆阀，也不适用坚硬者如包含体易损伤匀浆阀，也不适用 温度高易失活，能耗大。温度高易失活，能耗大。存在的问题存在的问题 2 2、高速珠磨法、高速珠磨法 原理原理：细胞和极细的研磨剂在搅拌桨细胞和极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间及珠子与作用下充分混合，珠子之间及珠子与细胞之间互相细胞之间互相剪切、碰撞剪切、碰撞，促使细胞，促使细胞壁破裂，释放内含物。壁破裂，释放内含物。几种常见珠磨器几种常见珠磨器 动力学方程动力学方程 间歇操作间歇操作:Ln(RLn(Rm m/(R/(Rm m-R)=Ln(D)=KtR)=Ln(D)=Kt 其中，其中，D=(1+KD=(1+K1 1/j)/j)j j 连续操作：连续操作：Ln(RLn(Rm m/(R/(Rm m-R)=KV/f=KR)=KV/f=K 上式中，上式中，t t是破碎时间；是破碎时间；K K、K K1 1、KK是破碎速是破碎速度常数；度常数；V V是破碎室内悬浮液的体积；是破碎室内悬浮液的体积；f f是是进料速度；进料速度；是平均停留时间；是平均停留时间；j j是破碎时是破碎时全混釜的数目，反映破碎室内悬浮液的流全混釜的数目，反映破碎室内悬浮液的流动状况。动状况。采用夹套冷却的方式实现温控采用夹套冷却的方式实现温控,效果较好效果较好;能耗与细胞破碎率成正比能耗与细胞破碎率成正比;问题：问题：高压匀浆比珠磨法破碎细胞的效果好？高压匀浆比珠磨法破碎细胞的效果好？温控和能耗温控和能耗 高压匀浆法与高速珠磨法的比较高压匀浆法与高速珠磨法的比较 项目项目 高压匀浆法高压匀浆法 高速珠磨法高速珠磨法 操作参数操作参数 少少 多，液体损耗大多，液体损耗大 连续操作时连续操作时 配备热换器进行级配备热换器进行级间冷却间冷却 兼具破碎和冷却，兼具破碎和冷却，减少产物失活减少产物失活 达到较高破碎率达到较高破碎率 需循环需循环2 2-4 4次次 一次操作一次操作 适用范围适用范围 团状、丝状真菌、团状、丝状真菌、较小革兰阳性菌不较小革兰阳性菌不宜，包含体不宜宜，包含体不宜 几乎所有的微生物几乎所有的微生物细胞，包括含有包细胞，包括含有包含体的基因工程菌含体的基因工程菌的破壁的破壁 X X-PressPress挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却至至-2525-3030，形成冰晶，用，形成冰晶，用500MPa500MPa以上以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀孔中挤的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀孔中挤出，冰晶体磨损和包埋在冰中的细胞变形出，冰晶体磨损和包埋在冰中的细胞变形引起细胞破碎。其优点是细胞碎片粉碎程引起细胞破碎。其优点是细胞碎片粉碎程度低，生物活性保持较好。度低，生物活性保持较好。3 3、超声破碎、超声破碎 机理：机理：声频高于声频高于151520kHz20kHz的超声波在高强的超声波在高强度声能输入时可以进行细胞破碎，破碎机理尚度声能输入时可以进行细胞破碎，破碎机理尚未清楚，可能与未清楚，可能与空化现象空化现象引起的冲击波和剪引起的冲击波和剪切力有关。切力有关。破碎效率破碎效率与声频、声能、处理时间、细胞浓与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。度及菌种类型等因素有关。优点优点：操作简便，液量损失少操作简便，液量损失少 存在问题存在问题：使敏感物质变性失活，噪声大，使敏感物质变性失活，噪声大，大容量时效率低，应用潜力有限。大容量时效率低，应用潜力有限。空化现象空化现象：在强声波作用下，引在强声波作用下，引起气泡形成，胀大和破碎的现象。起气泡形成，胀大和破碎的现象。锡箔纸测试空化强度与空化密度锡箔纸测试空化强度与空化密度 看得到的空化现象看得到的空化现象 超声波破碎仪超声波破碎仪 大功率大功率 超声波破碎仪超声波破碎仪 4 4、化学渗透法、化学渗透法 作用机理作用机理：某些某些有机溶剂，抗生素，表有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合剂，变性剂面活性剂，金属螯合剂，变性剂等化学等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内容物有选择地渗透出来，这种处理而使内容物有选择地渗透出来，这种处理方法叫渗透法。方法叫渗透法。问题问题：EDTAEDTA、甲苯、甲苯、Triton XTriton X-100100、盐、盐酸胍和脲的作用机理？酸胍和脲的作用机理？P70P70 EDTAEDTA：破坏细胞的外层膜：破坏细胞的外层膜 甲苯甲苯：溶解细胞膜的磷脂层：溶解细胞膜的磷脂层 Triton XTriton X-100100：溶解内膜的双磷脂层：溶解内膜的双磷脂层 盐酸胍和脲盐酸胍和脲：削弱溶质分子间的疏水：削弱溶质分子间的疏水作用，使疏水性化合物溶于水溶液作用，使疏水性化合物溶于水溶液 优点（相对机械破碎）优点（相对机械破碎）：对产物释出有一定的选择性；对产物释出有一定的选择性；细胞保持完整，碎片少，利于进一步提取；细胞保持完整，碎片少，利于进一步提取；核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。缺陷缺陷：时间长，效率低；时间长，效率低；化学试剂有毒；化学试剂有毒；通用性差通用性差 5 5、酶溶法、酶溶法 机理机理：利用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解。利用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解。常用的溶酶常用的溶酶：溶菌酶溶菌酶(lysozyme)(lysozyme)、-1,31,3-葡聚葡聚糖酶糖酶(glucanase)(glucanase)、-1 1，6 6-葡聚糖酶、蛋白酶葡聚糖酶、蛋白酶（protease)protease)、甘露糖酶、甘露糖酶(mannanase)(mannanase)、肽链内切、肽链内切酶（酶（endopeptidase)endopeptidase)、壳多糖酶、壳多糖酶(chitinase)(chitinase)、细、细胞壁溶解酶（几种酶的复合物）等。胞壁溶解酶（几种酶的复合物）等。优点优点：一定的选择性；一定的选择性；细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一步分离过程步分离过程 缺点缺点：（只能用于实验室（只能用于实验室）产物抑制造成效率低下；产物抑制造成效率低下；溶酶价格高；溶酶价格高；通用性差，