DB37T 2307-2013 长蛸（种质）.pdf

ICS 65.150B 51DB37山东省地方标准DB 37/T 23072013长蛸(种质)Species identification of Octopus minor2013-04-01 发布2013-05-01 实施山东省质量技术监督局发 布DB37/T 23072013I前言本标准按GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省海洋与渔业厅提出。本标准由山东省渔业标准化技术委员会归口。本标准负责起草单位：马山集团有限公司、中国海洋大学。本标准主要起草人：郑小东、王培亮、李琪、李开锋、钱耀森、于瑞海、左仔荣、常忠岳、崔玉龙。DB37/T 230720131长蛸(种质)1范围本标准规定了长蛸(Octopus minor(Sasaki,1920)的名称与分类、主要生物学性状、生长与繁殖、遗传特性及检测方法。本标准适用于长蛸种质检测与鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18654.2养殖鱼类种质检验 第2部分:抽样方法GB/T 18654.13养殖鱼类种质检验第13部分：同工酶电泳分析3名称与分类3.1学名长蛸 Octopus minor(Sasaki,1920),Octopus variabilis(Sasaki,1929)为其同物异名。3.2分类软体动物门（Mollusca），头足纲（Cephalopoda），八腕目（Octopoda），蛸科（Octopodidae），蛸属（Octopus）。4主要生物学性状4.1外部形态特征4.1.1外形胴体长卵形，胴长约为胴宽的2倍；体表光滑，具极细的色素色斑。长腕型，腕长约为胴长的6-7倍，各腕长度不等，第一对腕最长也最粗，其腕径约为其他腕径的两倍，腕式为1234，腕吸盘两行，基部为一行。雄性右侧第3腕茎化，甚短，仅约为左侧对应腕长度的二分之一；端器匙形，大而明显，约为全腕长度的六分之一。长蛸外部形态见图 1DB37/T 230720132图 1长蛸外部形态4.1.2可数性状4.1.2.1腕式:12344.1.2.2齿式：3 1 34.2内部构造特征口球内具颚片和齿舌,齿舌的中央齿为五尖型，第一侧齿甚小，齿尖居中，第2侧齿基部边缘较平，齿尖略偏一侧，第3侧齿近似弯刀状,边缘齿外侧具有发达的缘板结构。雄性的阴茎略呈“6”字形，膨胀部卷成螺旋状，阴茎部较短。漏斗器W型。半鳃片数约910个。5生长与繁殖特性5.1生长生长迅速，半年全长可到200mm，第二年春季一般可达300mm400mm。5.2繁殖5.2.1一年性成熟，繁殖期间有短距离洄游。5.2.2产卵习性:性腺一年成熟一次，卵分批产出，卵子长茄型，长径 13 mm20 mm，短径 4 mm6 mm。5.2.3繁殖水温:2026，最适水温 2224。5.2.4怀卵量:全长 540mm560mm 雌体，怀卵量 80140 个左右。6遗传特性6.1同工酶特性同工酶G3PD、AAT和SOD酶谱见图2图4DB37/T 230720133图 2长蛸同工酶 G3PD 酶谱图 3长蛸同工酶 AAT 酶谱图 4长蛸同工酶 SOD 酶谱6.2微卫星 DNA 分子检测特征微卫星DNA分子检测特征见图5、图6图 5引物 OM07 扩增长蛸肌肉组织 DNA 的凝胶电泳图谱图 6引物 OM09 扩增长蛸肌肉组织 DNA 的凝胶电泳图谱7检测方法7.1抽样方法参照GB/T 18654.2的规定执行。7.2同工酶分析7.2.1凝胶缓冲液和电泳缓冲液的制备凝胶缓冲液见附录A，电泳缓冲液见附录B。DB37/T 2307201347.2.2分析样品的制备电泳前取0.3g样品放入1.5 ml离心管，加入等体积的提取液后置于冰浴中研磨，研磨混合液置于冷冻离心机中，在4、12000rpm的条件下离心直至上清液澄清，取上清液冷冻保存备电泳用。7.2.3凝胶制备加淀粉30 g和制胶缓冲液254ml，在三角烧瓶内混匀，加热至沸腾，抽气，然后注入制胶模具中，冷却后，保鲜膜密封保存备用。7.2.4电泳步骤用手术刀在凝胶距离边三分之一（约2.5 cm）处切开，用适当大小的滤纸片蘸取样品提取液放入切口中。上样完毕后，用滤纸搭盐桥，在4条件下以40mA稳流进行电泳，电泳时间依酶的种类而不同。7.2.5染色、固定电泳结束后，用割胶弓将凝胶水平切割为1.3 mm厚的薄片，置于染色盒中，将配制好的染色液倒入染色盒后置于37 的恒温箱中进行染色。待酶显示足够的活性后，用10%的冰醋酸溶液终止反应。各种酶的染色液见附录C和附录D。7.2.6制干胶片取凝胶放于大小合适的玻璃纸上，压制封膜，风干，编号保存。7.2.7摄影、扫描用近焦镜头对凝胶及其谱带照相，或用扫描仪对干胶片电泳谱带进行扫描。7.2.8结果分析判定按GB/T 18654.13的规定执行。7.3微卫星 DNA 分析7.3.1基因组 DNA 的提取取长蛸肌肉0.1g，切碎至糜状，加入500l CTAB裂解液，加入20l protein K酶，混合入1.5ml的离心管，55裂解过夜。7.3.2引物序列引物序列见表1表 1引物序列OM07-RCTACCTTCCCTAACCTCTCACTAOM07-FCTAGGAGTCTGAACAACGTCAAOM09-RGTTGCTAACGTCATGATAACAGCOM09-FCAAATCATCACCACCGACATC7.3.3PCR 反应体系DB37/T 23072013510l体系组分见表2表 210l 体系组分10buffer Mg2+1lDNTP(2mM)1lMgcl2(25mM)0.6lPrime(10M)1lPrime（10M）1lr-Taq（5u/l）0.08lDNA模板(100ng/l)1lH2O4.32l7.3.4PCR 扩增条件94 预变性3 min,94变性1 min,Ta（OM07：64；OM09：56）1 min，退火30s,72延伸30s,38个循环，循环结束后72延伸5min。7.3.5聚丙烯凝胶酰胺电泳1000 ml的聚丙烯凝胶酰胺胶液配方:尿素(mw60.06)420 g，丙烯酰胺57 g，N,N-甲叉3 g，10TBE120ml，灭菌双蒸水定容至1000ml。PCR产物用6%的变性PAGE电泳，银染显色，冰醋酸固定，烘干以读取数据。DB37/T 230720136AA附录A（规范性附录）制胶缓冲液的配制A.1CT-7.0 制胶缓冲液三羟甲基氨基甲烷1.09 g，用柠檬酸调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。A.2CT-8.0 制胶缓冲液三羟甲基氨基甲烷 1.21 g，用柠檬酸调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。A.3CAPM-7.0 制胶缓冲液柠檬酸0.42 g，用3-氨甲基-吗啡啉调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。DB37/T 230720137BB附录B（规范性附录）电泳缓冲液配制B.1CT-7.0 电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷 16.35 g，用柠檬酸调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。B.2CT-8.0 电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷20g，用柠檬酸调至pH8.0，蒸馏水定容至1L。B.3CAPM-7.0 电泳缓冲液柠檬酸8.4g，用3-氨甲基-吗啡啉调至pH7.0，蒸馏水定容至1L。DB37/T 230720138CC附录C（规范性附录）染色缓冲液配制C.10.2M Tris-HCl,pH8.0三羟甲基氨基甲烷24.22g，用HCl调至pH8.0，蒸馏水稀释至1L。C.20.2M Tris-HCl,pH8.5三羟甲基氨基甲烷24.22g，用HCl调至pH8.5，蒸馏水稀释至1L。C.30.1M磷酸缓冲液，pH7.0磷酸氢二钠17.91g和磷酸二氢钠8.05g，溶解定容至1L。DDB37/T 230720139DE附录D（资料性附录）几种常见同工酶的染色液配制方法同工酶英文名和缩写试剂浓度用量甘油醛-3-磷酸脱氢酶Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseG3PDHa-Glycerolphosphate200 mgTris-HCl0.2mol/L pH8.525 mlNAD 基本保存溶液0.25%25 mlPMS 基本保存溶液0.5%0.5 ml苹果酸脱氢酶Malate dehydrogenateMDH苹果酸250 mgTris-HCl0.2mol/L pH9.525 mlNAD 基本保存溶液0.25%25 mlPMS 基本保存溶液0.5%0.5 ml乳酸脱氢酶Lactate dehydrogenaseLDH乳酸锂0.6 mlTris-HCl0.2mol/L pH8.525 mlNAD 基本保存溶液0.25%25 mlPMS 基本保存溶液0.5%0.5 ml超氧物歧化酶Superoxide dismutaseSOD氯化硝基四氮唑兰10 mg乙二胺四乙酸二钠盐100 mgTris-HCl0.2 mol/L pH9.525 ml乙醇2.5 mlPMS 基本保存溶液0.5%0.5 ml蒸馏水20 ml酯酶EsteraseEST丙酮1 ml固牢 RR 盐32 mg磷酸缓冲液0.1mol/L pH7.020 ml.乙醇2 ml-萘乙酸1%20 ml苹果酸酶Malic enzymeME苹果酸250 mgTris-HCl0.2mol/L pH8.525 mlMgCl21 mol/L1 mlNADP 基本保存溶液0.25%25 mlPMS 基本保存溶液0.5%0.5 mlTris-HCl0.2mol/L pH8.025 mlNAD 基本保存溶液0.25%25 mlPMS 基本保存溶液0.5%0.5 ml_