DB41T 1210-2016 农作物种子转基因成分检测方法.pdf

ICS 65.020.01 B 05 DB41 河南省地方标准 DB41/T 12102016 农作物种子转基因成分检测方法 2016-03-18 发布 2016-06-18 实施 河南省质量技术监督局 发 布 河南省地方标准公共服务平台河南省地方标准公共服务平台DB41/T 12102016 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由河南省农业厅提出。本标准起草单位：河南省种子管理站。本标准主要起草人：陈晓、戴钢、周新保、邓士政、徐立新、滕开琼、霍焕霞。本标准参与起草人：褚凰羽、张英华、张文玲、赵燕、宋新莉、肖琳琳、刘桂珍、闫瑾、韩赞平、吴刘记、常萍、刘景堂、杨晓明、李东升、王春源、程静、董根忠、郭瑞、郭敬东、李欣、魏艳敏、赵侠科。河南省地方标准公共服务平台河南省地方标准公共服务平台DB41/T 12102016 1 农作物种子转基因成分检测方法 1 范围 本标准规定了农作物种子转基因成分检测的术语和定义、检测程序、实验室要求及污染防范、检测要求、仪器和设备、样品预处理、核酸提取与纯化、定性 PCR 反应及检测、结果判定及检测报告。本标准适用于农作物种子转基因成分检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 19495.4 转基因产品检测 核酸定性PCR检测方法 农业部869号公告-3 转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt11及其衍生品种定性PCR方法 农业部869号公告-4 转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜MS1、RF1及其衍生品种定性PCR方法 农业部869号公告-5 转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜MS8、RF3及其衍生品种定性PCR方法 农业部869号公告-6 转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜MS1、RF2及其衍生品种定性PCR方法 农业部869号公告-7 转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米TC1507及其衍生品种定性PCR方法 农业部869号公告-8 转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种定性PCR方法 农业部869号公告-9 转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米MON810及其衍生品种定性PCR方法 农业部869号公告-10 转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米MON863及其衍生品种定性PCR方法 农业部869号公告-11 转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜GT73及其衍生品种定性PCR方法 农业部869号公告-12 转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米GA21及其衍生品种定性PCR方法 农业部869号公告-13 转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米NK603及其衍生品种定性PCR方法 农业部953号公告-1 转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米 Bt10 及其衍生品种定性 PCR 方法 农业部953号公告-2 转基因植物及其产品环境安全检测 抗病水稻 第2部分:生存竞争能力 农业部953号公告-3 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂油菜T45及其衍生品种定性PCR方法 农业部953号公告-4 转基因植物及其产品成分检测 抗除草剂油 菜 Oxy-235 及其衍生品种定性 PCR 方法 农业部1193号公告-2 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂油菜Topas 19/2及其衍生品种定性PCR方法 农业部1193号公告-3 转基因植物及其产品成分检测 抗虫水稻TT51-1及其衍生品种定性PCR方法 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 12102016 2 农业部1485号公告-1 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂棉花MON1445及其衍生品种定性PCR方法 农业部1485号公告-5 转基因植物及其产品成分检测 抗病水稻M12及其衍生品种定性PCR方法 农业部1485号公告-6 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂大豆MON89788及其衍生品种定性PCR方法 农业部1485号公告-7 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂大豆A2704-12及其衍生品种定性PCR方法 农业部1485号公告-8 转基因植物及其产品成分检测耐 除草剂大豆A5547-127及其衍生品种定性PCR方法 农业部1485号公告-9 转基因植物及其产品成分检测 抗虫耐除草剂玉米59122及其衍生品种定性PCR方法 农业部1485号公告-10 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂棉花LLcotton25及其衍生品种定性PCR方法 农业部1485号公告-12 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂棉花MON88913及其衍生品种定性PCR方法 农业部1485号公告-13 转基因植物及其产品成分检测 抗虫棉花MON15985及其衍生品种定性PCR方法 农业部1485号公告-14 转基因植物及其产品成分检测 抗虫转Bt基因棉花外源蛋白表达量检测技术规范 农业部1485号公告-15 转基因植物及其产品成分检测 抗虫耐除草剂玉米MON88017及其衍生品种定性PCR方法 农业部1782号公告-1 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂大豆356043及其衍生品种定性PCR方法 农业部1782号公告-4 转基因植物及其产品成分检测 高油酸大豆305423及其衍生品种定性PCR方法 农业部1782号公告-5 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂大豆CV127及其衍生品种定性PCR方法 农业部1782号公告-10 转基因植物及其产品成分检测 转植酸酶基因玉米BVLA430101构建特异性定性PCR方法 农业部1782号公告-11 转基因植物及其产品成分检测 转植酸酶基因玉米BVLA430101及其衍生品种定性PCR方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 农作物种子 农作物的种植材料或者繁殖材料，包括籽粒、果实、根、茎、苗、芽和叶等。3.2 转基因成分 通过基因工程技术改变农作物遗传构成，被转入到农作物基因组中的外源核酸序列。3.3 转基因成分检测方法 依据已知转基因转化事件信息，筛选覆盖同一作物已知转化事件共有元件，并用这些元件快速、大批量筛查农作物种子，定性检测其是否含有转基因成分的检测方法。河南省地方标准公共服务平台DB41/T 12102016 3 3.4 检出限 在给定的置信度内，可从样品中检出待测成分的最小浓度或最小量。3.5 阴性对照（阴参）不含待测基因的农作物种子或核酸样品。3.6 阳性对照（阳参）含待测基因的农作物种子或核酸样品。3.7 聚合酶链式反应(PCR)在反应溶液中，脱氧核糖核酸三磷酸、寡核苷酸引物在核酸聚合酶的作用下进行的催化反应。反应是一个循环的过程：通过加热使双螺旋核酸变性成为单链核酸、在合适的温度下引物和目标序列发生退火反应、在合适温度下结合在两条单链上的引物通过核酸聚合酶作用进行PCR延伸反应。3.8 引物 一条可互补结合在模板核酸链上的短的单链，提供3-OH末端作为核酸合成的起点，延伸合成模板核酸目的片段。3.9 内标准基因(内参)具有物种专一性且拷贝数恒定、不显示等位基因变化的保守核酸序列。3.10 空白对照 确知不含待测基因或低于检出限的样品。4 检测程序 农作物种子转基因成分检测程序见图 1。图1 农作物种子转基因成分检测程序 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 12102016 4 5 实验室要求及污染防范 按GB/T 19495.2的规定执行。6 检测要求 6.1 核酸制备 6.1.1 从送验样品中分取的试验样品应具有代表性，并有足够的数量。6.1.2 鲜活样品及被破碎后的样品，应在-20下保存。6.1.3 按照阴性、待测样品、阳性对照顺序提取核酸。6.1.4 每一份核酸样品都应经过质量检测。6.2 定性 PCR 检测 6.2.1 PCR 反应设置仅模板不同的空白对照、阴性对照、阳性对照至少各 2 个重复，待检样品 3 个重复，对照与待检样品同步反应、检测。6.2.2 最低检出限为 0.1%，阳性参照的含量为 0.1%。6.2.3 检测为阳性的样品，可进一步根据转化事件检测方法，确认转化事件。具体检测方法见 附录 A。7 仪器和设备 7.1 分样器。7.2 样品粉碎机。7.3 高速离心机（转速12000r/min）。7.4 天平(量程分别为0.001g，0.01g，0.1g)。7.5 移液器(量程分别为20L，200L，1000L)。7.6 高压灭菌锅。7.7 高恒温烘箱。7.8 生物安全柜。7.9 冰箱。7.10 微量核酸质量检测仪。7.11 高速离心机（转速6000 r/min）。7.12 移液器(量程分别为2.5 L，10L，20L，100L，200L，1000L)。7.13 超净工作台。7.14 制冰机。7.15 不间断电源。7.16 PCR循环仪。7.17 电泳仪和电泳槽。7.18 凝胶成像系统。7.19 超纯水仪。8 样品预处理 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 12102016 5 8.1 从送验样品中分取的试验样品应不少于 1000 粒，方法按照 GB/T 3543.2 扦样中实验室分样程序操作。8.2 分取的样品，应经自来水和无菌水冲洗。8.3 晾干后，用样品粉碎机将分取的试验样品粉碎至直径大小 0.1 mm 以下的颗粒，充分混匀,冷冻备用。9 核酸提取与纯化 9.1 SDS 法快速制备核酸 9.1.1 试剂 9.1.1.1 无水乙醇（C2H5OH）。9.1.1.2 37盐酸（HCl）。9.1.1.3 氯仿（CHCl3）。9.1.1.4 氢氧化钾（KOH）。9.1.1.5 三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris）。9.1.1.6 二水乙二铵四乙酸二钾盐（C10H14N2O8K22H2O，K2EDTA2H2O）。9.1.1.7 十二烷基磺酸钠（C12H25O4SNa，SDS）。9.1.1.8 异戊醇（C5H12O）。9.1.1.9 氯化钠(NaCl)。注：所有的试剂均分为析纯。9.1.2 溶液配制 9.1.2.1 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷溶解于约800mL水中，用1 mol/L盐酸溶液调pH至8.0，加水定容至1000mL，灭菌备用。9.1.2.2 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钾溶液(pH 8.0)称取20.2 g乙二铵四乙酸二钾，加入约70mL水中，再加入适量氢氧化钾，加热至完全溶解后，冷却至室温，用1mol/L氢氧化钾调pH至8.0，用水定容至100mL，灭菌备用。9.1.2.3 提取/裂解缓冲液 在约600mL水中加入30g十二烷基磺酸钠（SDS），充分溶解后，加入50mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，100mL乙二铵四乙酸二钾溶液，用盐酸或氢氧化钾调pH至8.0，加水定容至1000mL，灭菌备用。9.1.2.4 5mol/L NaCl 溶液 146.25g固体NaCl溶于水中，加水定容至500mL。9.1.2.5 TE 缓冲液(pH 8.0)在约800mL水中依次加入10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，2mL乙二铵四乙酸二钾溶液，用盐酸或氢氧化钾调pH至8.0，加水定容至1000mL，灭菌备用。9.1.2.6 洗涤溶液 河南省地方标准公共服务平台DB41/T 12102016 6 量取750mL无水乙醇，加水定容至1000 mL。9.1.3 核酸提取 9.1.3.1 取 30mg80mg 粉碎后的样品置入 1.5L 尖底离心管中，加入 600 L 裂解溶液，65C 水浴30min，期间颠倒混匀几次。9.1.3.2 加入 200 L 氯仿，轻柔晃动 5min。12000 r/min 离心 10min。9.1.3.3 转 450L 上清至一新离心管中，加入 450L 异戊醇,150 L 5 mol/L NaCL 溶液,静置