细菌培养基的制备、灭菌及接种、培养技术.ppt

1 实实 验验 二二 细菌培养基的配制、灭细菌培养基的配制、灭菌及接种、培养技术菌及接种、培养技术 2 第一部分第一部分 细菌培养基的制备、灭菌细菌培养基的制备、灭菌 目的要求目的要求 实验材料实验材料 实验程序实验程序 3 目目 的的 要要 求求 熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。掌握培养基和无菌水的制备方法。掌握培养基和无菌水的制备方法。掌握高压蒸气灭菌技术。掌握高压蒸气灭菌技术。4 实实 验验 材材 料料 药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等等。高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻璃珠等。璃珠等。5 实实 验验 程程 序序 玻璃器皿的洗涤和包装玻璃器皿的洗涤和包装 培养基的制备培养基的制备 无菌稀释水的制备无菌稀释水的制备 培养基和玻璃器材等的灭菌培养基和玻璃器材等的灭菌 6 实验程序实验程序1 （玻璃器皿的洗涤和包装）（玻璃器皿的洗涤和包装）清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。棉塞的制作棉塞的制作 包装培养皿和移液管等。包装培养皿和移液管等。7 实实 验验 程程 序序2 （培养基的种类）（培养基的种类）据组成成分可分为据组成成分可分为:1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。而成。3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。从培养基的物理状态可分为从培养基的物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。2.固体培养基：在液体培养基中加入固体培养基：在液体培养基中加入1530g/L左右的琼脂。左右的琼脂。3.半固体培养基：在液体培养基中加入半固体培养基：在液体培养基中加入35g/L左右的琼脂。左右的琼脂。8 实实 验验 程程 序序2 （培养基的种类）（培养基的种类）常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。9 实实 验验 程程 序序2（培养基的配制方法和步骤）（培养基的配制方法和步骤）1.取一个取一个300mL烧杯，装烧杯，装150mL蒸馏水。蒸馏水。2.按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。注意：注意：a.前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分 b.可加热促进各成分溶解可加热促进各成分溶解 c.加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失的水量。补充因蒸发而损失的水量。培养基配方 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 琼脂 蒸馏水 pH 数量 0.75g 1.5g 0.75g 3g 150mL 7.6 10 实实 验验 程程 序序2（培养基的配制方法和步骤）（培养基的配制方法和步骤）3.调调pH值：用值：用10 NaOH调调pH至至7.6，用精，用精密密pH试纸对照。试纸对照。4.分装：将培养基分装于分装：将培养基分装于5支试管，其余全部支试管，其余全部倒入倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。锥形瓶中，分别塞上棉塞。注意注意不要污染棉塞和瓶口不要污染棉塞和瓶口。5.包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。6.灭菌备用：培养基灭菌后必须在灭菌备用：培养基灭菌后必须在37下恒下恒温培养温培养24h，确定无菌生长，方可使用。，确定无菌生长，方可使用。11 实实 验验 程程 序序2 （培养基的分装和斜面培养基的制作）（培养基的分装和斜面培养基的制作）每支试管装的量为试管高度的每支试管装的量为试管高度的1/41/3.斜面长度为试管长度的斜面长度为试管长度的1/31/2.12 实验程序实验程序2 （培养基的配制方法和步骤）（培养基的配制方法和步骤）13 实验程序实验程序3 （无菌稀释水的制备）（无菌稀释水的制备）取一个取一个250mL的锥形瓶装的锥形瓶装90(或或99)mL蒸馏水，蒸馏水，放放30颗玻璃珠颗玻璃珠(用于打破活性污泥、菌块或土壤用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒颗粒)于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。另取另取5支支18mm180mm的试管，分别装的试管，分别装9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。14 实验程序实验程序4 （培养基和玻璃器材等的灭菌）（培养基和玻璃器材等的灭菌）加热灭菌有加热灭菌有干热灭菌干热灭菌和和湿热灭菌湿热灭菌。干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法干热灭菌的操作方法 a.将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至160并维持并维持2h；b.把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到50左右，才能将物品取出。左右，才能将物品取出。15 实验程序实验程序4 （培养基和玻璃器材等的灭菌）（培养基和玻璃器材等的灭菌）湿热灭菌：高压蒸气灭菌法湿热灭菌：高压蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌法的操作步骤如下：高压蒸气灭菌法的操作步骤如下：1.灭菌锅内加入一定量的水。灭菌锅内加入一定量的水。2.将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。注意：器物不能装得太满。注意：器物不能装得太满。3.接通电源，进行加热。接通电源，进行加热。4.排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为计指示温度为100时关闭排气阀；或当排出的蒸气相时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。16 实验程序实验程序4 （培养基和玻璃器材等的灭菌）（培养基和玻璃器材等的灭菌）5.当压力达当压力达1.05kg/cm2(灭菌器内的温度为灭菌器内的温度为121)即开始灭菌，使其维持即开始灭菌，使其维持1530min。对热不稳定的培。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力(0.56kg/cm2)，延长时间。，延长时间。6.灭菌时间一到，切断电源，灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时待压力降至零时，才能，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水。剩余水。7.待培养基冷却后置于待培养基冷却后置于37恒温箱内培养恒温箱内培养24h，若无，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。17 18 实验程序实验程序4 （培养基和玻璃器材的灭菌方法）（培养基和玻璃器材的灭菌方法）间歇灭菌法：间歇灭菌法：即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭菌。养基的灭菌。操作方法：操作方法：a.待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，次，每次在每次在100煮沸煮沸3060min，连续，连续3d重复进行。重复进行。b.在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37恒温条件下培养恒温条件下培养24h，这样可以使每次蒸煮后未杀死残，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。c.第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在37恒温条件下培养恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。，确定无菌才能使用。19 实验程序实验程序4（培养基和玻璃器材的灭菌方法）（培养基和玻璃器材的灭菌方法）过滤除菌法过滤除菌法：不能用加热灭菌的不能用加热灭菌的液体物质（如维生液体物质（如维生素、血清），一般素、血清），一般可用细菌过滤器进可用细菌过滤器进行除菌。行除菌。20 第二部分第二部分 细菌纯种分离、培养和接细菌纯种分离、培养和接种技术种技术 目的要求目的要求 实验材料实验材料 实验程序实验程序 21 目目 的的 要要 求求 掌握从环境中分离培养细菌的方法，从掌握从环境中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能。而获得若干种细菌纯培养技能。掌握几种接种技术。掌握几种接种技术。22 实实 验验 材材 料料 无菌培养皿无菌培养皿(直径直径90mm)10套、无菌移液管套、无菌移液管1mL2支、支、10mL1支支。营养琼脂培养基营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或湖水瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶，瓶，无菌稀释水无菌稀释水90mL1瓶、瓶、9mL5管。管。其它：接种环、酒精灯、恒温箱。其它：接种环、酒精灯、恒温箱。23 实实 验验 程程 序序 细菌的纯种分离细菌的纯种分离 细菌的接种方法细菌的接种方法 24 实验程序实验程序1 （细菌的纯种分离）（细菌的纯种分离）稀释平板法稀释平板法 平板划线法平板划线法 25 实验程序实验程序1（细菌的纯种分离（细菌的纯种分离稀释平板法）稀释平板法）1.取样。取样。2.将将1瓶瓶90mL和和5管管9mL无菌水排列好，用记号笔无菌水排列好，用记号笔依次编上依次编上101、102、103、104、105、106。在无菌操作条件下，用在无菌操作条件下，用10mL的无菌移液管吸取的无菌移液管吸取10mL水样水样(或其它样品或其它样品)加入编号为加入编号为101无菌水无菌水(内内含玻璃珠含玻璃珠)中，将移液管吹洗三次，用手摇中，将移液管吹洗三次，用手摇10min将将颗粒状样品打散。即为颗粒状样品打散。即为101浓度的菌液。用浓度的菌液。用1mL无无菌移液管吸取菌移液管吸取1mL 101浓度的菌液于编号为浓度的菌液于编号为102无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为102浓度浓度菌液。同样方法，依次稀释到菌液。同样方法，依次稀释到106。26 实验程序实验程序1（细菌的纯种分离（细菌的纯种分离稀释平板法）稀释平板法）稀释液的制备稀释液的制备 27 实验程序实验程序1（细菌的纯种分离（细菌的纯种分离稀释平板法）稀释平板法）3.平板的制作平板的制作 取取10套无菌培养皿编号，套无菌培养皿编号，104、105、106各各3个，另一个，另一个为空气对照。个为空气对照。取取1支支1mL无菌移液管从无菌移液管从浓度小的菌液浓度小的菌液开始，以开始，以106、105、104为序分别吸取为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内菌液于相应编号的培养皿内(每次吸取每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀)。28 实验程序实验程序1（细菌的纯种分离（细菌的纯种分离稀释平板法）稀释平板法）3.平板的制作平板的制作 加热培养基，当其冷至加热培养基，当其冷至45左右时，右手拿装有培养基的锥左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于置于30培养培养2448h，然后观，然后观察结果。察结果。29 实验程