DB34T 2254-2014 水产品中氯霉素残留的检测-胶体金免疫层析法.pdf

ICS 67.050 B 50 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 22542014 水产品中氯霉素残留的检测胶体金免疫层析法 Detection of chloramphenicol residue in aquatic products-Colloidal gold immunochromatographic method 文稿版次选择 2014-12-17 发布 2015-01-17 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 22542014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由合肥市渔政监督管理站提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：合肥市畜牧水产技术推广中心、合肥市渔业协会、杭州南开日新生物技术有限公司。本标准起草人：赖年悦、孙德祥、桑丽雅、周作友、徐薇、陈友顺、杨锐、曹海、张军、夏俊华、陈元生、程定文、方凯、钱继银、桂淦、胡积清、戴靖、陈晓荣、徐丽、沈亭海、徐经云、季曙春。DB34/T 22542014 1 水产品中氯霉素残留的检测-胶体金免疫层析法 1 范围 本标准规定了水产品中氯霉素（Chloramphenicol，CAP）残留的检测胶体金免疫层析法的原理、试剂和材料、仪器和设备、测定步骤、结果判断及表述、结果确证的方法。本标准适用于鱼、甲鱼、龟肌肉组织和虾、蟹去壳、肠腺的可食用组织中氯霉素残留的快速筛查检测。本方法的检出限为 0.3 g/kg。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 本法为竞争抑制法，将氯金酸用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。样品中残留的氯霉素，经乙酸乙酯提取，正己烷净化，滴加在氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板的加样孔中，样品溶液以硝酸纤维素（NC）膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用缓慢向另一端渗移，在移动过程中，样品溶液中的氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，从而抑制了抗体和检测线上特异性结合抗原的结合，未被氯霉素结合的抗体与检测线上的抗原反应，并通过胶体金的颜色而显示红色条带。用胶体金读卡仪或目测比较板/卡上控制线（C 线）和检测线（T 线）上红色条带的有无及颜色的相对深浅进行判定。当试样中的氯霉素含量达到或超过本方法检出限时，检测线较控制线显色淡甚至无显色，判定为阳性；反之，当试样中的氯霉素含量在本方法检出限以下或无残留时，检测线与控制线显色一致或偏深，判定为阴性。4 试剂和材料 4.1 特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的二级水。4.2 乙酸乙酯（C4H8O2）。4.3 正己烷（C6H14）。4.4 氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板 4.4.1 氯霉素结合抗原：偶联率为 110120（载体蛋白：CAP）。4.4.2 抗氯霉素抗体：多抗或单抗。多抗效价应大于 5 000（间接 ELISA 法），或有效抗体含量应大于 0.05 mg/mL；特异性应大于 5 000（间接抑制 ELISA 法）。单抗效价应大于 15 000（间接 ELISA 法），或有效抗体含量应大于 0.5 mg/mL；特异性应大于 5 000（间接抑制 ELISA 法）。抗体相对亲和力应大于 3.0109（结合率下降 50时，相对应的抗体浓度的倒数）。DB34/T 22542014 2 4.4.3 样品垫：玻璃纤维或纸质薄片。4.4.4 金释放垫：聚酯纤维片，免疫金释放时间小于 5 min，释放效率大于 80。4.4.5 NC 膜：4 cm 毛细管时间 121 s149 s。4.4.6 吸水垫：滤纸或玻璃纤维或吸水纸。4.4.7 背衬：PVC。4.4.8 塑料模板。4.4.9 PBST 缓冲液。4.4.10 储存与使用。密封包装，干燥阴凉处保存，用前恢复至室温，即开即用。5 仪器和设备 5.1 电子天平：感量 0.01 g。5.2 均质机：转速8000 r/min。5.3 离心机：离心力3 000 g。5.4 氮气或空气吹干仪：加热温度 60。5.5 微量移液器：10 L100 L，100 L1 000 L。5.6 胶体金读卡仪：测量精度 0.02 RLU（0.4 RLU）。6 测定步骤 6.1 试样制备 鱼去鳞、去皮，取肌肉部分；甲鱼、龟取肌肉部分；虾、蟹去壳、肠腺，取可食部分。切成 0.5 cm0.5 cm0.5 cm 的小块后混合，用均质机制成糜状。6.2 提取 称取 2.0 g(0.1 g)均质后的样品于 5 mL 离心管中，加入 3 mL 乙酸乙酯，剧烈振荡 3 min，室温下，3 000 g 离心 5 min；移取 2 mL 上清液于 5 mL 离心管中，置于 60水浴或吹干仪中，用氮气或空气吹至近干；依次加入 0.3 mL 正己烷、0.3 mL PBST 缓冲液，充分混匀；静置 2 min，下层溶液待测。6.3 测定 6.3.1 取出氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板，恢复至室温，置于水平台面上。吸取 6.2 中待测液的下层溶液 100 L，加至氯霉素免疫胶体金快速检测试剂板的加样孔中，在 3 min5 min 内目测或通过胶体金读卡仪读取结果。6.3.2 空白对照：每批样品需做一孔空白对照，以 PBST 缓冲液（4.4.9）代替试样提取液，按 6.3.1进行。6.3.3 平行测定：每个样品的平行样数量2，各自按 6.2 和 6.3.1 进行。注：不同试剂板制造商的产品组成和操作会有细微的差别，应严格按说明书要求规范操作。7 结果判断及表述 7.1 试剂板有效性判定 DB34/T 22542014 3 7.1.1 失效检测试剂板：空白对照控制线（C 线）不出现红色条带（如图 1），则检测试剂板失效，不能进行检测。7.1.2 有效检测试剂板：空白对照控制线（C 线）和检测线（T 线）均出现红色条带，而且 T 线比 C线颜色深或一样深（如图 2），则检测试剂板有效，可进行检测。7.2 结果及表述 7.2.1 阴性：试样检测线（T 线）出现红色条带，且颜色比控制线（C 线）深或一样深（如图 2），结果为阴性，氯霉素残留量 0.3 g/kg）。7.2.2 阳性：试样检测线（T 线）出现红色条带，但颜色比控制线（C 线）浅或检测线（T 线）未出现红色条带（如图 3），结果为阳性（氯霉素残留量0.3 g/kg）。8 结果确证 本方法检测结果为阳性的样品，需用现行有效的 LC-MS/MS 方法或 GC-MS/MS 方法进行确证。_