细菌内毒素的简介.ppt

细菌内毒素检查法在药品和医细菌内毒素检查法在药品和医疗器械检查中的应用疗器械检查中的应用 细菌内毒素检查细菌内毒素检查 本讲座共分三部分 一、基础部分 二、标准部分 三、实验操作部分 一、基础部分一、基础部分 1.前言前言 防止输注用药品及器械的热原污染，是临床上十分重要的。半个多世纪以来，热原检查法对保证注射用药品安全发挥了重要作用。但随着制药工业的发展，该方法已不完全适合许多品种的热原检查。为此，人们研究了一种替代热原检查法的方法，这就是我们今天正在研究和扩大应用的细菌内毒素检查法。细菌内毒素检查是输注药品及器械质量控制中的一项重要指标。1.1细菌内毒素检查法 1885年美国的W.H.Howell发表了一篇有关鲎血的化学组成和凝集方面的研究成果，这可以说是鲎试验历史的开端。1956年，美国动物学家F.Bang发表论文鲎的一种细菌性疾病，阐明了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。1964年F.Bang和J.Levin提出了鲎血凝集的初步机理，1968年正式建立鲎试验（Limulus test,LT)方法。1980年USP20版；1987年欧洲药典、1989年英国药典1989增补本、1988年日本药典第11增补本、1993年中国药典1990年版第二增补本开始收载细菌内毒素检查法。1.2 1.2 细菌内毒素在我国的发展细菌内毒素在我国的发展 在我国，1975年开始鲎试剂的研制，1979年开始将其用于放射性药品的细菌内毒素检查方法研究，1983年开始用于输液制剂热原检查的协作研究。1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法，允许4种药品采用细菌内毒素检查法作为热原检查的初试方法；1993年中国药典1990年版第二增补本开始收载细菌内毒素检查法。1995年版中国药典规定13个品种进行细菌内毒素检查法。2000年版药典规定60个品种进行细菌内毒素检查法。2005年版药典规定133个品种进行细菌内毒素检查法。2 2 有关术语及相关内容有关术语及相关内容 2.1热原反应病人在静脉输注药剂后可能发生的发热、冷感、寒颤、恶心、呕吐、头痛、腰及四肢关节痛、肤色灰白、白细胞下降、血管通透性增强、昏迷、休克、死亡等一系列症状称为热原反应。2.2 热原所有能引起热原反应的物质称为热原。药品中的热原主要是细菌内毒素。一般可以认为：细菌内毒素是热原，但热原不等于细菌内毒素。2.3细菌内毒素检查法2005年版中国药典定义为：系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。2.4鲎试剂我国生产的鲎试剂系鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，用于细菌内毒素检查。根据检查方法分为凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂；根据鲎试剂与内毒素反应的专一程度分为普通鲎试剂和特异性鲎试剂。特异性鲎试剂是专一对内毒素反应的鲎试剂。鲎试剂灵敏度用符号表示，单位用EU/ml表示。2.5鲎 鲎是一种栖生于海洋的低等无脊椎动物，出现在古代泥盆纪，现存于世的有三属四种，常见的有两种，美洲鲎和东方鲎 2.6细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞外壁层上的特有结构，即脂多糖，具有广泛的生物活性，以致热居首。其量值以国际单位（IU)或内毒素单位（EU)表示，现规定1 IU=1 EU。2.7细菌外毒素与细菌内毒素 细菌外毒素是一种由活菌合成并释放出来，对热敏感的蛋白质。细菌内毒素是一种对热抵抗，且只有当菌体死亡裂解或人工破碎后方可释放来。外毒素与内毒素的主要区别外毒素与内毒素的主要区别 区别要点 外毒素 内毒素 来源 G+、部分G-G-存在不位 胞浆内合成分泌至菌体外 细胞壁成分 化学成分 蛋白质 脂多糖 稳定性 不稳定，60-80破坏 160-240破坏 毒性作用 强，有选择性 弱 抗原性 强，可制成类毒素 弱 举例 肉毒毒素，白喉外毒素 大肠杆菌内毒素 内毒素的主要生物活性：1 发热反应 2 白细胞反应 3 代谢性酸中毒 4 感染性休克 5 弥漫性血管内凝血（DIC)2.8细菌内毒素标准品 细菌内毒素标准品分为细菌内毒素国际标准品、国家标准品和工作标准品。在我国，细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素。1996年WHO 建立第二批国际内毒素标准品（94/580，10000IU），规定1IU=IEU。981是用IS2为基准标定的我国第6批国家标准品，共生产8批。细菌内毒素工作品分为冻干品和液体两种剂型，均可用于鲎试剂复核、干扰试验和实验中的阳性对照。本品为一次性使用。2.9细菌内毒素检查用水 2005年版中国药典规定细菌内毒素检查用水系指与灵敏度0.015EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂24h不产生凝集反应的灭菌注射用水。3 细菌内毒素的化学结构、量值和限值 3.1化学结构 细菌内毒素的本质是脂多糖（LPS)，主要有两部分组成：多糖和类脂A。多糖部分又可进一步分为O-特异性多糖链、核心寡聚糖。O-特异性脂多糖一般由3-6个单糖通过糖苷键相联形成低聚糖单位聚集而成，是LPS分子中最易变异的成分。核心寡聚糖分为内核和外核。外核由数种己糖组成，内核含有庚糖特殊的酮糖，这部分结构对不同菌株的LPS基本相似。类脂A是LPS的毒性及生物活性中心。典型的类脂A含有一个以1，6-糖苷键相连的D-氨基葡萄糖双糖组成的基本骨架，双糖骨架的游离羟基及氨基可携带长链脂肪酸和磷酸基团。不同种属细菌合成的类脂A的分子组成及其骨架上的取代基团性质有差异。3.2细菌内毒素的量值 1996年WHO建立第二批国际内毒素标准品(94/580，10000IU),规定1IU=1EU。我国国家标准品981是用IS2为基准标定的我国第6批国家标准品。每支含内毒素9000EU。3.3 细菌内毒素的限值 供试品细菌内毒素限值按一下公式确定L=K/M，式中L为供试品内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K为按给药途径，临床无任何不良反应的内毒素阈剂量，以EU/kg表示，注射剂K=5EU/kg/hr。M为人用最大剂量，以ml/kg/hr,mg/kg/hr,U/kg/hr表示，中国人均体重按60kg计算。4 4中国药典中国药典20052005年版细菌内毒素检查法的修订内容年版细菌内毒素检查法的修订内容 中国药典2005年版较中国药典2000年版有重大修订，主要修订内容如下：4.1.定义改变：2005年版药典定义细菌内毒素检查法为利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。4 4中国药典中国药典20052005年版细菌内毒素检查法年版细菌内毒素检查法的修订内容的修订内容 2000年版定义为：利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。4.2.把中国药典2000年版的细菌内毒素检查法应用指导原则，合并入附录E细菌内毒素检查法。4.3.明确了细菌内毒素检查有两种方法：凝胶法和光度测定法，供试品检测时，可用其中任意一种方法进行试验，只有当测定结果有争议时，以凝胶法结果为准。4.4 细菌内毒素检查用水的要求提高，内毒素含量降到了0.015EU/ml，光度测定法用细菌内毒素检查用水的内毒素含量小于0.005EU/ml。4.5增加了供试品溶液的制备这一项，明确了供试品溶液的PH 值在6.08.0范围内，配制酸、碱及缓冲盐的容器应去除内毒素，水用细菌内毒素检查用水。4.6鲎试剂灵敏度的定义有所改变 2000年版的定义是：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度；2005年版的定义是：在本检查法规定的条件下使鲎试剂产生凝聚的最低内毒素浓度 4.7.把原来的凝胶法细分为凝胶限量试验和凝胶半定量试验。4.8.凝胶限量试验中，阴性对照和阳性对照的平行管数都增加为2支。4.9.增加了凝胶半定量试验，通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。4.10.较详细讲述了光度测定法的方法。二、标准部分二、标准部分 2.1 细菌内毒素检查法（中国药典2005年版）2.2 医用输液、输血、注射器细菌内毒素检查法GB/T14233.2-93 2.3生物材料和医疗器材的细菌内毒素检查法 （卫生部药政局1997年药发1997第81号）医用输液、输血、注射器细菌内毒素检查法医用输液、输血、注射器细菌内毒素检查法 生物材料和医疗器械的细菌内毒素检查法生物材料和医疗器械的细菌内毒素检查法 与中国药典与中国药典2005 2005 年版的比较年版的比较 法规 项目 医用输液、输血 注射器BET 生物材料和 医疗器械BET 中国药典 2005年BET 除热原 程序 玻璃器具180干烤2h获250 30min,塑料器具30%双氧水4h，无热原水冲洗后60 烘干。250 至少30 Min,或180 至少2h,也可用其他适宜的方法。250 至少1h 也可用其他适宜的方法，并应确证不干扰BET的检查 鲎试剂灵敏度复核 检测能出现阳性结果阴性结果的4个连续2倍等比稀释液，平行4管，371保温602min,最高浓度的4管均为阳性，最低浓度的4管均为阴性。按公式计算 当s0.365时按=log-1(x/4)计算鲎试剂的灵敏度；s0.365时，测定无效。检测2.0、0.5、0.25 的内毒素平行4组，同时做4管阴性，最高浓度的4管均为阳性，最低浓度的4管均为阴性。S 标准差 X 4个连续内毒素稀释液最低阳性结果浓度的对数值。检测2.0、0.5、0.25的内毒素平行4组，同时做2管阴性，最大浓度2.0的4管均为阳性，最低浓度0.25的4管均为阴性 NC均为阴性 c=lg-1(x/4)在0.52.0间有效 3422xx干扰试验 未涉及 比较鲎试剂在水中和样品中的灵敏度，各平行4组，结果Es、Et均应0.52.0之间，样品的稀释不大于MVD,3个批号 比较鲎试剂在水中和样品中的灵敏度，各平行4组，结果Es、Et均应0.52.0之间，样品的稀释不大于MVD,3个批号 2个以上厂家的鲎试剂 检查法 供试品至少3个 浸提介质：内毒素含量0.05EU/ml 输液器10ml,输血器15ml,反复荡洗 5次后两端密闭，37 2h后合并 2支NC,2支PC,2支供试品。样品稀释到MVD，1支NC,1支PC,1支PPC 2支供试品。样品稀释到MVD，2支NC,2支PC,2支PPC 2支供试品。结果判断 PC为阳性 NC为阴性 样品均为阴性，合格 PC为阳性 PPC为阳性 NC为阴性 样品均为阴性，合格 PC为阳性 PPC为阳性 NC为阴性 样品均为阴性，合格 其他 鲎试剂灵敏度0.25EU/ml 供试品细菌内毒素限量不超过0.5EU/ml 样品溶液不稀释，当结果出现阳性时，12稀释，4支，1支阳，无热原注射用水0.05EU/ml 为浸提介质 细菌内毒素检查用水内毒素含量小于0.015EU/ml 三、试验操作三、试验操作 1.简述 1.1 鲎试剂灵敏度复核项的目的不仅是考察鲎试剂灵敏度和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确和试验条件是否符合规定。因此每个实验室再将一批新的鲎试剂用于试验前应进行鲎试剂灵敏度复核项试验。1.2干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制作用。1.3 供试品检查时，阴性对照、阳性对照、和供试品阳性对照必须同时进行，否则结果无效。2试验材料及用具 天平、电热干燥箱（180300）、恒温水浴箱（37 1）、漩涡混合器、鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号）、细菌内毒素工作品、细菌内毒素检查用水；其他试验用具如移液枪、封口膜、一次性安剖等。3.3.凝胶实验技术凝胶实验技术 3.1凝胶法的实验程序 1试验准备：试剂、仪器及用具等 2 确定药品的细菌内毒素限值L 3选择鲎试剂的灵敏度 4 计算供试品的最大有效稀释倍数或最小有效浓度 5 鲎试剂灵敏度复核 6 药品与鲎试剂相容性的初筛试验 7 供试品干扰试验 8 干扰试验的验证 9 供试品日常的内毒素限量检查 3.2.鲎试剂灵敏度复核 3.2.1内毒素标准溶液的制备 取细菌内毒素国家