VPS34蛋白抑制剂PIKⅢ体外广谱抗冠状病毒作用研究.pdf

动物医学进展,():P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e研究论文V P S 蛋白抑制剂P I K体外广谱抗冠状病毒作用研究收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目()作者简介:于啸洋(),女,吉林吉林人,硕士研究生,主要从事动物病毒学研究.通讯作者于啸洋,矫立敏,葛晨晨,李嘉琪,尚超,薛书江,金宁一,李霄(延边大学农学院,吉林延吉 ;中国农业科学院长春兽医研究所,吉林长春 ;吉林正业生物制品股份有限公司,吉林吉林 )摘要:为了寻找有效抗冠状病毒感染的治疗靶点,用C C K 法和结晶紫法检测V P S 蛋白抑制剂P I K对细胞的敏感性,通过C C K 法检测P I K抗病毒活性,通过病毒滴度及R T P C R检测P I K对冠状病毒复制的影响.结果显示,P I K可以抑制多种冠状病毒对细胞的杀伤作用,提高细胞活性并且减少冠状病毒复制.V P S 蛋白抑制剂P I K对S A R S C o V 、P E D V和T G E V种冠状病毒感染具有抑制作用,可以减少病毒复制,P I K可能是一种有效的抗冠状病毒药物.关键词:冠状病毒;自噬;型磷脂酰肌醇 激酶;P I K;抗病毒药物中图分类号:S 文献标识码:A文章编号:()冠状病毒(C o r o n a v i r u s)是单股正链R NA病毒,属冠状病毒科正冠状病毒亚科,分为、和个属.冠 状 病 毒 包 括 猪 流 行 性 腹 泻 病 毒(P E D V)和猪传染性胃肠炎病毒(T G E V),对全球养猪业造成重大经济损失.部分冠状病毒对人类具有高致病性,如严重急性呼吸综合征病毒(S A R S C o V)、中东呼吸综合征病毒(ME R S)、新型冠状病毒(S A R S C o V ).S A R S C o V 引起的新型冠状病毒肺炎(C OV I D )在世界范围内大流行,且多国频现变异株.病毒的迭代变异对现有疫苗和抗病毒药物提出挑战 .新发冠状病毒已对公共卫生安全造成严重威胁.型磷脂酰肌醇 激酶(P I K C)也称V P S ,在低等真核生物、植物和哺乳动物体内存在 .V P S 蛋白是一种内体激酶,在胞内可通过与不同的多蛋白复合物结合而行使多种功能.V P S 蛋白在哺乳动物中的生物学功能与小泡运输的调节有关,包括自噬、内吞和吞噬作用等 .自噬参与病毒宿主之间的相互作用.冠状病毒可以劫持内质网、高尔基体和中间体形成病毒蛋白和完整的病毒粒子,这一过程被发现与自噬有关.现阶段预防或治疗冠状病毒感染的选择仍然相当有限,寻找多种冠状病毒复制所必需的共同宿主因子是广谱抗病毒的有效途径.自噬调节可能代表着一种潜在的抗冠状病毒治疗策略.为进一步研究抑制V P S 蛋白激活,对冠状病毒感染进行有效预防和治疗,本研究用V P S 蛋白抑制剂P I K预处理细胞后再感染病毒.结果显示,P I K可以减少病毒对细胞活性的抑制作用,并具有广泛抗冠状病毒的作用.结果表明,V P S 蛋白抑制剂P I K可能是一种有效的抗冠状病毒药物.材料与方法材料细胞与病毒P I K,美国M e dC h e m E x p r e s s公司产品;猪睾丸细胞S T、非洲绿猴肾细胞V e r oE、猪肾细胞P K 和宫颈癌人源h A C E H e L a细胞由本实验室冻存;P E D V、T G E V、S A R S C o V 病毒由本实验室保存(关于S A R S C o V 的试验 在 生 物 安 全 三 级 实 验 室 中 进 行).DMEM、高糖培养基、青霉素链霉素溶液和胎牛血清,美国H y c l o n e公司产品;C C K ,日本同仁公司产品;T r i z o l总R NA提取试剂盒,生工生物工程(上海)有限公司产品.引物与探针用于扩增P E D V基因组内部序列的引物探针参照文献,引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.T a qM a n探针序 列 为P E D V P:G T T G C C AT T A C C A C GA C TC C T G C T A C ,探针的 端标记的荧光报告基团是F AM,端标记的荧光淬灭基团为T AMR A,上、下 游 引 物 分 别 为P E D V F:C T T C C C AG C G T AG T T GAGAT T G T 和P E D V R:T T G C C T C T G T T G T T A C T T G GAGAT .方法 细胞培养将S T、V e r oE、P K 和h A C E H e l a细胞分别培养于培养基中(m L/LF B S、g/L青霉素链霉素),在 、体积分数为 的C O细胞培养箱中培养,取生长良好的对数生长期细胞用于试验.病毒扩增将V e r oE 和P K 细胞以/孔接种于孔板内,设置对照组,感染病毒前用P B S清洗遍.用S A R S C o V (MO I)、T G E V(MO I)和P E D V(MO I)分别感染细胞,孵育h后弃病毒液,用P B S再次清洗遍,每孔添加m L的 g/LDMEM培养基.其中P K 细胞中加入含有 g/m L胰酶的DMEM培养基.待细胞出现病变后,反复冻融次.r/m i n离心 m i n,取上清,得到扩增好的病毒,m滤膜过滤后置 保存待用.C C K 法测P I K对细胞的敏感性以及抗病毒活性将S T、V e r oE、P K 和H e l a h A C E 细胞分别消化后,通过细胞计数以 个/孔的密度接种于 孔板,培养 h后,分别接入病毒.接毒前h,P I K组将配置好的P I K加入每孔.P I K浓 度 分 别 为、m o l/L.每组设置个复孔.在、体积分数为 C O的条件下培养 h后取 孔板,每孔加入 LC C K 试剂,避光孵育h,放入酶标仪检测O D n m值.细胞增 值活力()试验组O D /对照 组O D .对 照 组 存 活 率 为 .结晶紫法测P I K对细胞的敏感性将S T、V e r oE、P K 细胞分别消化后,通过细胞计数以 个/孔的密度接种于孔板,培养 h后,将P I K加 入 每 孔.P I K浓 度 分 别 为、m o l/m L.在 、体积分数为 C O的条件下培养 h后中止培养.用P B S清洗遍,m L/L多聚甲醛固定 m i n,加入g/L结晶紫溶液染色 m i n,缓慢小心的吸取染色液,P B S漂洗遍,风干后用相机拍照.P I K在不同时间点抑制病毒在细胞中的复制根据和试验结果,将V e r oE、P K 细胞分别消化后,通过细胞计数以 个/孔的密度接种于孔板,培养 h后,设置P I K药物组和对照组.P I K药物组在接毒前处理h,将P I K加入每孔,并设置浓度分别为、m o l/L,在、h时吸取上清液,以 稀释后感染 孔板,h后用R e e d M u e n c h法计算T C I D.提取病毒R NA将V e r oE 细胞消化后,通过细胞计数以 个/孔的密度接种于 孔板,培养 h后,设置P I K药物组和对照组.P I K药物组在接毒前处理h,将P I K加入每孔,终浓度分别为 、m o l/L,h后分别接入P E D V(MO I).V e r oE 细胞在 h收集上清.按照T r i z o l说明书从细胞上清液中分别提取P E D V的总R NA,置 保存.实时荧光定量P C R将P E D V质粒标准品 倍梯度稀释为 ,以此为模板,双蒸水为阴性对照,进行荧光定量P C R,结果绘制标准曲线.以中提取的R NA为样本,进行实时荧光定量P C R扩增,每个样本个复孔.反应程序为 m i n,m i n,s,m i n.数据分析使用G r a p h P a dP r i s m进行数据统计分析,采用单因素方差和t检验比较各组差异,P 表示差异显著,P 表示差异极显著.结果V P S 抑制剂P I K增加病毒感染细胞的存活率用S T、V e r oE、P K 和H e l a h A C E 细胞进行对比试验(图),图 A和图 D为P I K分别处理h A C E H e l a和V e r oE 后新型冠状病毒攻毒 hC C K 试验;图 B和图 E为P I K分别处理H e l a h A C E 和V e r oE 后新型冠状病毒贝塔毒株攻毒 hC C K 试验;图 G和图 H为P I K分别处理H e l a h A C E 和V e r oE 后新型冠状病毒德尔塔毒株攻毒 hC C K 试验;图 C和图 F为P I K分别处理S T和P K 细胞后猪传染性胃肠炎病毒攻毒 hC C K 试验;图 I为P I K处理V e r oE 细胞后猪 流行性腹泻 病毒攻毒 hC C K 试验.与对照组相比,P I K可以显著增加在不同细胞系且不同冠状病毒感染细胞后的存活率(P,P).P I K抑制剂不仅作用于T G E V和P E D V,还可以作用于S A R S C o V 的各种毒株,提示P I K具有广谱抗冠状病毒作用.V P S 抑制剂P I K的细胞毒性研究结晶紫结果见图,作用 h后与对照组相比,动物医学进展 年第 卷第期(总第 期)、m o l/m L试验浓度下的抑制剂P I K 对细胞存活率并无明显杀伤作用,表明试验浓度的P I K 具有相对安全性.分别为、m o l/m L A r e,m o l/m L图P I K增加冠状病毒感染后细胞存活率F i g V p s i n h i b i t o r i n c r e a s e sc e l l s u r v i v a l a f t e r c o r o n a v i r u s i n f e c t i o n图V P S 抑制剂对细胞无明显药物毒性作用F i g V P S i n h i b i t o rh a sn os i g n i f i c a n td r u gt o x i ce f f e c to nc e l l sV P S 抑制剂抑制冠状病毒在细胞中的复制病毒滴定检测,在病毒感染前用P I K处理h,在、h吸取细胞上清液并检测其病毒滴度,结果显示T G E V试验组病毒随时间增于啸洋等:V P S 蛋白抑制剂P I K体外广谱抗冠状病毒作用研究值,各 浓 度 组 活 毒 水 平 在 h达 到 峰 值,其 中m o l/L和m o l/L组与m o l/L组相比差异显著(P)(图 A).P E D V试验组病毒在感染细胞后随时间增加.经过P I K处理后的病毒滴度 低 于 对 照 组.在 h达 到 峰 值,其 中 m o l/L组与m o l/L组相比差异显著(P)(图 B).结果表明,P I K处理后细胞上清液中病毒粒子减少.提示抑制自噬诱导蛋白V P S 活性具有抑制病毒复制的作用.荧光定量R T P C R检测细胞上清液中的病毒N基因拷贝数.为了进一步确定涉及病毒复制的关键因素,在病毒感染之前,用V P S 抑制剂P I K,浓度分别为 、m o l/L处理细胞h(图),结果表明,与对照组相比,V e r oE 细胞的病毒载量显著降低.图V P S 抑制剂预处理细胞h后感染病毒的病毒滴度F i g V i r u s t i t e r so f i n f e c t e dc e l l sa f t e rp r e t r e a t m e n tw i t hv p s i n h i b i t o r f o rh图V e r oE 细胞上清液中的猪流行性腹泻病毒N基因拷贝数F i g T h eNg e n ec o p yn u m b e ro fP E D Vi nt h es u p e r n a t a n to fV e r oE c e l l s讨论V P S 是一种类磷酸肌醇 激酶,在自噬和内体转运及其他细胞功能中发挥重要作