6种活性化合物对旋毛虫各期虫体的体外杀伤作用.pdf

动物医学进展,():P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e种活性化合物对旋毛虫各期虫体的体外杀伤作用收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目();甘肃省科技厅重点研发项目(Y F F A )作者简介:徐媛滨(),女,甘肃白银人,硕士,主要从事人兽共患病及公共卫生问题研究.通讯作者徐媛滨,张念章,李文卉,刘垠鞠,牛栋玉,陈卫刚,付宝权,孙晓林(甘肃农业大学,甘肃兰州 ;中国农业科学院兰州兽医研究所,甘肃兰州 )摘要:为了筛选有效活性化合物对旋毛虫不同发育时期虫体的体外杀伤作用,采用体外培养的方式测定三氯生等种活性化合物对旋毛虫的体外杀伤效果,用倒置显微镜观察旋毛虫形态并计数.结果显示,三氯生对旋毛虫肌幼虫、成虫、新生幼虫均有明显杀伤作用(P),没食子酸辛酯对旋毛虫成虫和新生幼虫有明显杀伤作用(P),吡咯 羧酸、邻羟基苯乙酸、亚精胺盐酸盐、,戊二胺仅对旋毛虫新生幼虫有杀伤作用(P).亚精胺盐酸盐在高浓度下对肌幼虫有杀伤作用但效果不佳.结果表明,这种活性化合物对旋毛虫各时期有虽有不同程度的杀伤作用,但只有三氯生对旋毛虫个时期均具有明显的杀伤效果,该筛选结果为进一步开展体内试验研究提供了依据.关键词:活性化合物;旋毛虫;三氯生;体外试验;杀伤作用中图分类号:S 文献标识码:A文章编号:()旋毛虫病是由旋毛形线虫(T r i c h i n e l l as p i r a l i s)引起的一种人兽共患寄生虫病,也是一种广泛的食源性寄生虫病,可感染包括人在内的 多种哺乳动物.人主要通过生食或半生食含有旋毛虫包囊的肉或者肉制品而感染旋毛虫,人旋毛虫病的主要症状是全身发热、腹痛、眼睑水肿、心肌炎、全身肌肉疼痛等,重症患者甚至可因并发症而死亡.我国 年就发生过 例旋毛虫病,主要是由于食入含有旋毛虫包囊的猪肉所致.有调查表明,年我国中部省份小型猪场旋毛虫感染率为 .旋毛虫不仅对公众健康造成严重危害,而且严重影响肉食品安全生产.目前,治疗旋毛虫病的药物主要为阿苯达唑.尽管阿苯达唑存在生物利用度较低,已有产生耐药性的趋势,不能完全有效地抑杀宿主体内新生幼虫和肌幼虫包裹,副作用明显等缺点,但至今仍无其他药物可以在治疗效果、药理毒性等方面优于阿苯达唑.因此,研发和筛选安全高效的治疗旋毛虫病药物已成为防治该病的重点.越来越多的研究开始从活性化合物中寻找具有抗寄生虫活性的药物.天然植物尤其是驱虫药用植物的提取物对旋毛虫有不同程度的杀伤作用 .白藜芦醇是植物应对压力和真菌感染时产生的一种非黄酮类植物抗毒素分子,主要存在于饮食中,如葡萄、桑椹、花生、红酒和葡萄汁中.这类化合物对旋毛虫新生幼虫和成虫均有驱虫作用,但在体外对肌幼虫无明显致死作用.血根碱对幼虫、肌幼虫和成虫均有致死作用,对成虫有明显的破坏作用;在体内试验中,血根碱对旋毛虫感染不同阶段(成虫前期、迁徙、包囊)的小鼠也均有治疗作用.本试验选取的种活性化合物均具有抗寄生虫作用,但其目前对旋毛虫的作用还未可知,因此本研究旨在评价其在体外对旋毛虫不同发育时期虫体的杀伤效果,为进一步研发防治旋毛虫病的实际临床应用提供参考资料.材料与方法材料实验动物大鼠、昆明小鼠均购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心.旋毛虫虫种本研究所用旋毛虫为旋毛虫河南株(T r i c h i n e l l as p i r a l i s,T),昆 明 小 鼠 传 代保种.试 验 用 化 合 物三 氯 生(t r i c l o s a n,M r ,纯度);没食子酸辛酯(o c t y lg a l l a t e,M r ,纯度为 );吡咯 羧酸(p y r r o l e c a r b o x y l i ca c i d,M r ,纯度为 );邻羟基苯乙酸(h y d r o x y p h e n y l a c e t i ca c i d,M r ,纯度为 );,戊二胺(,d i a m i n o p e n t a n ed i h y d r o c h l o r i d e,M r ,纯度为 );亚精胺盐酸盐(s p e r m i d i n et r i h y d r o c h l o r i d e,M r ,纯度 )共种活性化合物,均购自美国S e l l e c k生物科技有限公司.在二甲基亚砜(DM S O)中制备种活性化合物的储备溶液,种活性化合物初始浓度均为 mm o l/L,于 冰箱保存备用.所有工作浓度均通过R o s w e l lP a r k M e m o r i a l I n s t i t u t e (R PM I )培养液稀释.主要仪器设备离心机,德国艾本德公司产品;磁力搅拌器,上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司产品;细胞计数器,柯桥医疗器械厂产品;荧光倒置显微镜,日本尼康公司产品;隔水式恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司产品.方法旋毛虫成虫、新生幼虫及肌幼虫的分离将用于保种的昆明小鼠脱颈处死,通过胃蛋白酶法消化肌肉获得肌幼虫.获得成虫时,将肌幼虫经口灌服S D大鼠,d后处死,分离小肠,纵行剖开.用无菌生理盐水清洗肠段,然后将小肠段平铺于覆有滤布的平皿上,于无菌生理盐水中孵育h后,收集成虫.将收集的成虫置于含有抗生素(U/m L青霉素、g/m L链霉素)和 m L/L胎牛血清的R PM I 培养液的培养基中,、体积分数为的C O下孵育 h,用 目筛网过滤分离新生幼虫,r/m i n离心m i n,弃去上清液获得新生幼虫.试验设计分别将旋毛虫成虫、新生幼虫和肌幼虫培养于含有R PM I 培养基 孔微量滴定板中(含 U/m L青霉素、g/m L链霉素和 m L/L胎牛血清),每孔加入 条旋毛虫和每种药物的稀释液.每种药物稀释的具体方法为:将每种药物稀释浓度梯度为、mm o l/L,并设置空白对照组和DM S O对照组,DM S O的最终浓度按照在同一次试验中试验组最大用药浓度中DM S O浓度构建,做孔重复.为了确立本试验中使用的种活性化合物的合适浓度,先前已经进 行了初步预 试验.将肌幼虫 孵育、h;成虫和新生幼虫孵育 h.然后于倒置显微镜中观察并计数.虫体死亡率平均死亡虫体数/平均虫体总数 .虫体呈C型或直线型,或观察 s以上,虫体没有运动迹象,可判定虫体死亡.数据分析用S P S S 处理数据,以平均数标准差(xS D)表示,采用方差分析进行差异显著性分析.当P 时,差异显著.结果种活性化合物对肌幼虫的体外杀伤效果种活性化合物中筛选出对肌幼虫有杀伤作用的有种,其中三氯生体外杀伤效果最佳(表).在加入药物 h时,三氯生浓度为mm o l/L时肌幼虫死亡率为,此时肌幼虫活力明显下降(图 B).加入药物 h后,三氯生浓度由 mm o l/L提高至mm o l/L时,虫体的致死率由 提高至(P);此时肌幼虫出现明显死亡形态:虫体呈“C”型,虫体观察 s未发现任何活动迹象(图 C);培养 h时,三氯生对肌幼虫的致死率由 mm o l/L时的 提高至mm o l/L时的(P),虫体呈现明显的发黑僵化(图 D).亚 精 胺 盐 酸 盐 浓 度 为 mm o l/L、mm o l/L时对肌幼虫的致死率为、(P),亚精胺盐酸盐在高浓度下对肌幼虫有杀伤作用但效果不佳;其他种在各浓度梯度下对旋毛虫肌幼虫均无显著的杀伤效果.种活性化合物对成虫的体外杀伤效果种活性化合物中筛选出对成虫有杀伤作用的有种(表),其中三氯生和没食子酸辛酯在浓度为mm o l/L和mm o l/L时对成虫的杀伤效果最强,死亡率均达到 (P),此时虫体僵直不动呈直线型死亡(图 B);其他种在各浓度梯度下对旋毛虫成虫均无显著的杀伤效果.种活性化合物对新生幼虫的体外杀伤效果各浓度的种活性化合物作用 h后对旋毛虫新生幼虫均有显著的致死作用(表),死亡率显著高于对照组(P),虫体僵直不动(图 B).讨论活性化合物因其广泛分布在动植物、海洋生物和微生物中,且普遍具有消炎、抗菌和抗氧化等生理活性,所以在疾病治疗中的应用越来越广泛.若能从这些化合物中筛选出具有抑杀虫体的活性物质用以制作抗寄生虫药物的前体,将有助于缩短抗寄生虫新药的研发周期.因此,本试验选取种具有抗寄生虫作用的活性化合物,研究了其在体外抑杀旋毛虫的效果.结果表明,三氯生对旋毛虫各时期均具有明显的致死作用,没食子酸辛酯对旋毛虫成虫和新生幼虫有明显的致死作用,吡咯 羧酸、邻羟基苯乙酸、亚精胺盐酸盐、,戊二胺仅对旋毛虫新生幼虫有显著的致死作用.动物医学进展 年第 卷第期(总第 期)表不同浓度的种活性化合物对肌幼虫体外作用不同时间的致死率T a b l eL e t h a l i t yo f a c t i v ec o m p o u n d sa td i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so nm u s c l e l a r v a ea td i f f e r e n t t i m ei nv i t r o化合物名称N a m eo f c o m p o u n d观察时间/hO b s e r v a t i o nt i m e不同浓度死亡率/(xS D)M o r t a l i t ya td i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s mm o l/L mm o l/Lmm o l/Lmm o l/L没食子酸辛酯O c t y l g a l l a t e 吡咯 羧酸P y r r o l e c a r b o x y l i ca c i d 三氯生T r i c l o s a n 邻羟基苯乙酸 H y d r o x y p h e n y l a c e t i ca c i d ,戊二胺,D i a m i n o p e n t a n e d i h y d r o c h l o r i d e 亚精胺盐酸盐S p e r m i d i n e t r i h y d r o c h l o r i d e 空白对照组B l a n kc o n t r o l g r o u p DM S O对照组DM S Oc o n t r o l g r o u p 注:与空白对照组比较P,与空白对照组比较P.N o t e:C o m p a r e dw i t ht h eb l a n kc o n t r o l g r o u pP,C o m p a r e dw i t ht h eb l a n kc o n t r o l g r o u pP A药物处理前;B药物处理 h;C药物处理 h;D药物处理 hAP r e t r e a t m e n t;B ha f t e r t r e a t m e n t;C ha f t e r t r e a t m e n t;D ha f t e r t r e a t m e n t图mm o l/L三氯生体外作用不同时间对旋毛虫肌幼虫形态的影响()F i g E f f e c t so f mm o l/Lt r i c l o s a no nt h em o r p h o l o g yo fT r i c h i n e l l as p i r a l i sm u s c l e l a r v a ea td i f f e r e n t t i m e si nv i t r o()三氯生作为一种广谱抗菌剂,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及一些霉菌和酵母菌均有抑制作用.研究发现,三氯生除了对多种细菌有显著抑制作用外,还能在体外抑制柔嫩艾美耳球虫、布氏锥虫、巴贝斯虫、恶性疟原虫和弓形虫速殖子等顶复门原生动物的生长和存活,在体内降低伯氏疟原虫、恶性疟原虫和弓形虫速殖子的荷虫量 ,而经三氯生处理的寄生虫显示出广泛的质膜破裂.不同浓度的化合物对机体的影响也不同,三