非洲猪瘟病毒p72蛋白可溶性表达及鉴定.pdf

动物医学进展,():P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e非洲猪瘟病毒p 蛋白可溶性表达及鉴定收稿日期:基金项目:江苏省重点研发计划(现代农业)重点项目(B E ,B E );江苏省农业自主创新资金项目(C X();扬州大学科技创新团队项目()作者简介:黄霞(),女,江苏常州人,博士研究生,主要从事非洲猪瘟免疫逃逸机制及疫苗研究.通讯作者黄霞,康喜龙,韩顺子,孟闯,潘志明,焦新安(扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室/扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心/扬州大学农业农村部农产品质量安全生物性危害因子(动物源)控制重点实验室/扬州大学农业与农产品安全国际合作联合实验室,江苏扬州 )摘要:为获得可溶性的非洲猪瘟病毒(A S F V)p 蛋白,将重组质粒p C o l d p 分别与种分子伴侣质粒进行融合表达,S D S P AG E鉴定表达产物;以重组蛋白H i s p 免疫小鼠制备多克隆抗体,通过W e s t e r nb l o t和间接免疫荧光方法鉴定多克隆抗体与真核表达蛋白的免疫反应性.结果显示,重组蛋白H i s p 与伴侣蛋白p G T f 或p T f 共表达后,实现了可溶性表达.以可溶性H i s p 蛋白免疫小鼠后,获得H i s p 多克隆抗体,抗体效价达到 ;W e s t e r nb l o t和间接免疫荧光的试验结果显示多抗血清可特异性识别真核表达的p 蛋白.说明利用分子伴侣融合表达的A S F Vp 可溶性蛋白具有较好的免疫反应性,为抗A S F V药物的研发提供了候选蛋白.关键词:非洲猪瘟病毒;p 蛋白;分子伴侣;可溶性表达;多克隆抗体中图分类号:S ;S 文献标识码:A文章编号:()非洲猪瘟(A f r i c a ns w i n e f e v e r,A S F)是由非洲猪瘟病毒(A f r i c a ns w i n e f e v e rv i r u s,A S F V)引起的猪高致死性出血性疾病,在我国被列为一类动物疫病.自 年月传入我国以来,迅速蔓延全国,对我国的养猪业造成了严重的经济损失.现今在尚无安全有效疫苗的情况下,许多学者将目光投向了抗病毒药物,以期为A S F V的防控提供新思路,小分子抑制剂就是其中一类具有潜力的靶向药物.A S F V属于非洲猪瘟病毒科,是非洲猪瘟病毒属的唯一成员,系目前已知唯一由虫媒介导的大型双链D NA囊膜病毒.根据不同毒株,A S F V基因组的长度约为 k b,有 个开放阅读框(o p e nr e a d i n gf r a m e,O R F),可编码 种蛋白质.其中,由B L基因编码的p 蛋白,是A S F V的重要结构蛋白.由于其具有构象中和表位和抗原性稳定,常被用作血清学检测和免疫制剂的靶标 ,而p 蛋白三维结构的成功解析也使得其成为了小分子抑制剂的重要靶标.原核表达系统具有低成本、易操作、可大量制备目的蛋白等优点,一直是表达外源蛋白的首选方案.然而也存在外源蛋白易形成包涵体等问题.已有研究表明p 蛋白在大肠埃希氏菌表达系统,如p E T c()、p C o l d 等中均以包涵体形式表达,这为后期的蛋白纯化和变复性造成困难,并且通过复性得到的蛋白也很难保证其活性 .本研究以我国流行的非洲猪瘟病毒A n h u i X C GQ毒株p 全长基因为研究对象,通过分子克隆构建p C o l d p 原核表达质粒,将完整的p 蛋白分别与种分子伴侣在大肠埃希氏菌中共表达,从而使p 蛋白以可溶性形式表达,为抗A S F V药物的研发提供候选抗原蛋白,同时也为进一步研究p 蛋白的生物学功能研究奠定基础.材料与方法材料菌株、质粒、细胞及实验动物引物及基因序列合成工作由南京金斯瑞公司生物科技公司完成;HE K T细胞、B L (D E)(p G E X P p )重组菌、p C o l d载体、p CMV m y c表达载体及p CMV m y c p 质粒由江苏省人兽共患病学重点实验室保存;Ec o i lDH 和B L (D E)感受态细胞,南京诺唯赞 生 物 公 司 产 品;分 子 伴 侣p K J E、p G K J E、p G r o、p G T f 和p T f 感受态细胞,宝生物工程(大连)有限公司产品;周龄雌性B a l b/c小鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物实验均通过扬州大学伦理委员会的审查.主要试剂琼脂糖凝胶回收试剂盒、限制性内切酶、P r i m e s t a rm a xD NAP o l y m e r a s e,宝生物工程(大连)有限公司产品;C l o n ee x p r e s s o n es t e pc l o n i n g一步法连接试剂,南京诺唯赞生物公司产品;快速质粒小提试剂盒,北京天根生物科技有限公司产品;I P T G、L 阿拉伯糖(L A r a b i n o s e)、四环素(T e t r a c y c l i n e)、氨苄青霉素,生工生物工程(上海)股份有 限 公 司 产 品;A n t i H i st a ga n t i b o d y,瑞 士R O CHE公司产品;羊抗鼠酶标二抗,德国C a l b i o c h e m公司产品;H i sB i n dP u r i f i c a t i o nK i t,N o v a g e n公司产品;A l e x aF l u o r 标记的山羊抗小鼠I g G(HL)及W e s t e r nb l o t细胞裂解液,碧云天公司产品;L i p o f e c t a m i n eTM ,美国I n v i t r o g e n公司产品.主要仪器P C R仪、G E L D o c 凝胶成像分析系统和蛋白质电泳仪,美国B i o R e d公司产品;Am e r s h a mI m a g e r 拍照系统,美国G EH e a l t h c a r e公司产品;细胞恒温培养箱,T h e r m o公司产品.方法重组表达质粒的构建及鉴定根据A S F VA n h u i X C GQ株p 密码子优化后的基因序列设计P C R引 物,H i s p F:AT G GAG C T C G G T A C C C T C GAGAT G G C GAG C G G T G G C G C G T T C T (下划线部分为X h o酶切位点);H i s p R:AG C AGAGAT T A C C T AT C T AGAT T AG G T G C T AT AA C G C AG C A C C G (下 划 线 部 分 为X b a酶切位点).以密码子优化的基因序列为模板,扩 增 出 目 的 片 段,聚 合 酶 链 反 应(p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n,P C R)扩增程序为:s、s、m i n,共 个循环;P C R产物经 g/L琼脂糖凝胶电泳验证正确后,对目的片段进行回收纯化.使用限制性内切酶X h o和X b a对p C o l d载体质粒进行双酶切.通过C l o n e e x p r e s so n es t e pc l o n i n gk i t连接目的片段与线性化质粒p C o l d,并转化至大肠埃希氏菌感受态细胞DH 中;随机挑选单菌落接菌提取质粒,酶切验证正确后,进行测序鉴定,测序正确的重组质粒命名为p C o l d p .将验证正确的重组质粒和空载体质粒分别转化至含伴侣质粒的感受态细胞中,通过含氯霉素(m g/L)和氨苄青霉素(m g/L)的双抗性L B平板筛选阳性克隆并进行P C R验证,获得的阳性菌分别命 名 为p C o l d p p K J E、p C o l d p p G K J E、p C o l d p p G r o、p C o l d p p G T f 和p C o l d p p T f .可溶性表达体系的建立及筛选对p C o l d p p K J E、p C o l d p p G K J E、p C o l d p p G r o、p C o l d p p G T f 和p C o l d p p T f 进行诱导表达,程序如下:过夜培养的菌液以 m L/L接种量接种至L B液体培养基(含氨苄青霉素 m g/L和氯霉素 m g/L),同时根据伴侣质粒种类加入不同诱导剂,即含p G T f 质粒需加入g/LT e t r a c y c l i n e,含p G K J E 伴侣质粒需加入L A r a b i n o s e和g/LT e t r a c y c l i n e,其余种菌株培养基中均需加入L 阿拉伯糖,并设置不同L 阿拉伯糖浓度组别、g/L;当菌液的O D n m值达到时,静置培养 m i n,并添加终浓度为mm o l/L的I P T G,在 条件下诱导表达目的蛋白,诱导时长为 h.收集细菌菌体,以P B S洗涤菌体次后,按照 比例加入P B S重悬菌体,超声破碎菌体;于、r/m i n离心 m i n,分别收取诱导后各表达菌株的上清和沉淀,通过S D S P AG E观察并确定有效的伴侣蛋白.可溶性重组蛋白的纯化及鉴定p C o l d p p T f 诱导表达后,收集菌体,用 倍体积纯化用的B i n d i n gb u f f e r重悬菌体.超声裂解重悬的菌体,收集上清.按照H i sB i n dP u r i f i c a t i o nK i t纯化步骤纯化H i s p 蛋白,并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s,S D S P AG E)及W e s t e r nb l o t进行鉴定分析.多克隆抗体的制备及鉴定以纯化的可溶性蛋白H i s p 作为抗原,以常规程序及方法免疫小鼠,制备多克隆抗体.以纯化的G S T p 蛋白为包被抗原,采用间接酶联免疫吸附试验(e n z y m e l i n k e di mm u n o s o r b e n ta s s a y,E L I S A)测 定 抗 体 效 价,以P B S免疫组血清为阴性对照,计算抗体效 价.以H i s p 和G S T p 为检测抗原,进行S D S P AG E电泳,以 稀释的多抗血清作为一抗,使用羊抗鼠酶标二抗(稀释)作为二抗,对多克隆抗体进行W e s t e r nb l o t鉴定.多克隆抗体的应用评价在 孔细胞培养板中 接 种HE K T细 胞,其 细 胞 密 度 生 长 至 时,利用L i p o f e c t a m i n eTM 分别将p CMV m y c和p CMV m y c p 重 组 质 粒 转 染 至HE K T细胞,转染后细胞置于、体积分数为的C O培养箱培养 h.弃去细胞培养液上清,P B S轻柔清洗遍,加入冰甲醇,在室温下固定细胞 m i n,P B S清洗遍;以 m g/m LB S A的P B S封闭h,加入多抗血清()作为一抗,孵育黄霞等:非洲猪瘟病毒p 蛋白可溶性表达及鉴定过夜;P B S洗涤细胞次,加入A l e x aF l u o r 标记的山羊抗小鼠I g G(HL)二抗(),在 的条件下,避光孵育h;以P B S洗涤次后,m L/L甘油将细胞封片,于荧光显微镜下观察结果.同时,将p CMV m y c和p CMV m y c p 质粒以同样方法转染HE K T细胞 h后,P B S清洗次,使用W e s t e r nb l o t裂解液裂解细胞,于、r/m i n离心m i n,