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蓝塘猪和大约克猪TPM_3基因单核苷酸多态性分析_朱良瑞.pdf
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蓝塘猪 约克 TPM_3 基因 核苷酸 多态性 分析 朱良瑞
2023(15):47-50,56畜牧科学收稿日期:2022-08-11;修回日期:2023-04-26基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(G2000016104);广东省自然科学基金团队项目(4205804)作者简介:朱良瑞(1979),女,副教授,硕士,研究方向为动物遗传育种,358524341 .通信作者:李加琪(1965),男,教授,博士,博士生导师,研究方向为动物遗传育种,jqli .DOI:10.13881/ki.hljxmsy.2022.08.0085 蓝蓝蓝蓝蓝蓝蓝蓝蓝蓝蓝蓝蓝蓝蓝蓝塘塘塘塘塘塘塘塘塘塘塘塘塘塘塘塘猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪和和和和和和和和和和和和和和和和大大大大大大大大大大大大大大大大约约约约约约约约约约约约约约约约克克克克克克克克克克克克克克克克猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪 T T T T T T T T T T T T T T T TP P P P P P P P P P P P P P P PM M M M M M M M M M M M M M M M3 3 3 3 3 3 3 3 3 3基基基基基基基基基基基基基基基基因因因因因因因因因因因因因因因因单单单单单单单单单单单单单单单单核核核核核核核核核核核核核核核核苷苷苷苷苷苷苷苷苷苷苷苷苷苷苷苷酸酸酸酸酸酸酸酸酸酸酸酸酸酸酸酸多多多多多多多多多多多多多多多多态态态态态态态态态态态态态态态态性性性性性性性性性性性性性性性性分分分分分分分分分分分分分分分分析析析析析析析析析析析析析析析析 朱良瑞1,2,李加琪2,袁晓龙2(1.荆州职业技术学院,湖北 荆州 434020;2.华南农业大学 动物科学学院/广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室/国家生猪种业工程技术研究中心,广州 510642)中图分类号:S828.2 文献标识码:A 文章编号:1004-7034(2023)15-0047-05摘 要:为了了解蓝塘猪与大约克猪 TPM3基因编码序列(coding sequence,CDS)的多态性,试验选择健康肥育蓝塘猪 30 头和大约克猪 35 头作为试验动物,采用 PCR 方法扩增两个猪群的 TPM3基因cDNA 序列,测序分析其单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)。结果表明:在猪TPM3 基因 cDNA 序列中查找到 6 个 SNPs 位点,涵盖猪 TPM3 基因 5非编码区(UTR)和 CDS 区;在 5UTR 仅存在 U-45 SNP 位点,为单碱基缺失;在 CDS 区存在 E3-440、E3-452、E4-565、E6-650、E6-658 共 5 个 SNPs 位点,包括 3 个单碱基转换,1 个单碱基颠换,1 个单碱基缺失。E3-440 由丙氨酸变为甘氨酸,E3-452 由谷氨酸变为甘氨酸,E4-565 由异亮氨酸变为缬氨酸,E6-650 由异亮氨酸变为苏氨酸,E6-658 由亮氨酸变为色氨酸;E3-452 与谷氨酸含量关联,谷氨酸作为影响猪肉的主要鲜味物质之一对猪肉风味有影响。说明 E3-452 可作为影响猪肉鲜味的 SNP 位点。关键词:蓝塘猪;大约克猪;TPM3基因;单核苷酸多态性;肉质性状 开放科学(资源服务)标识码Open Science Identity(OSID)原肌球蛋白 3(tropomyosin3,TPM3或-TM)作为原肌球蛋白家族(TM)中的一员,是一种肌动蛋白结合蛋白。TM 是肌原纤维中的一种,是组成微丝的重要部分,是肌肉收缩过程中的重要调节蛋白质1-2。目前已确认 TM 中有 4 种基因,分别为 TPM1(或-TM)、TPM2(或-TM)、TPM3(或-TM)、TPM4(或-TM)基因3-5。TPM3基因是华南农业大学动物科学学院实验室应用 RT-PCR-DHPLC 基因表达半定量技术从蓝塘、大约克、杜洛克三个猪品种背最长肌中筛选出的差异表达基因,并且发现 TPM3基因在蓝塘猪背最长肌中的表达量高于其他品种6。通过猪和仓鼠辐射杂种细胞系平板(IMpRH)分析发现,猪 TPM3 基因定位在 4 号染色体(SSC4)上,猪 TPM3基因连锁微卫星标记 SW512 主要与眼肌面积、背膘厚、骨肉比、日增重等肉质指标相关7。邢璐等8研究发现,肌原纤维、肌小节的长度越长,肌肉的风味越好。王赛楠等9对蓝塘猪与大约克猪的 cDNA 进行了消减差异分析,结果发现,两者 TPM3基因的表达具有一定差异。蓝塘猪属于典型的华南型品种,具有体型小、早熟、易肥、性情温顺、耐高温和高湿等特点10-11。大约克猪是典型的外来引进猪种,具有生长速度快的特性12-13。初步推测,TPM3基因可能是影响不同品种猪肉质差异的重要基因。单核苷酸多态性(SNP)作为第三代分子标记,已被广泛用于生物群体遗传多样性分析、分子标记辅助选择的研究14。SNP 是指由于单个核苷酸(A、T、C或 G)发生变异引起的基因组水平上 DNA 序列的多态性,直接影响氨基酸密码子的转录,从而影响分子水平上蛋白质的翻译15,是生命遗传物质基因变异的主要存在形式。SNP 的每代碱基突变率约为 218-8,具有遗传稳定性强、位点数量多且分布广、易于大规模自动化检测的优势,现已成为理想的遗传标记742023(15):47-50,56畜牧科学之一。在功能基因上,某个 DNA 区域的单碱基替代无论出现在编码区(CDS)或非编码区(UTR),都可能会对基因的功能产生影响,进而影响其控制的性状。从生物遗传性状上看,处于 CDS 的 SNP 为 cSNP(coding SNP,cSNP),由同义 SNP 与非同义 SNP 组成,其中非同义 SNP 突变会导致氨基酸发生变化,从而影响蛋白质功能,特别是发生在结构功能区域的SNP 尤为重要16。SNP 是一种重要的分子遗传标记,在家畜的育种工作中,可以通过检测和鉴定影响重要性状的 SNP 提高选择效率与效能,加快遗传选育进度,提高经济效益17-18。目前,可以利用各种方法与单核苷酸变异位点进行关联来分析候选基因,如果找到了与目的性状有关的 SNP 位点,便可通过芯片筛选个体并进行优缺点分析,最后通过杂交、回交等方式改良品种19。需要注意的是,虽然 SNP 与猪的重要性状存在关联,但在不同品种猪群中,具体效果可能会有所不同17。对不同品种猪的 SNP 进行分析,其结果有助于更全面地认识不同品种猪的起源和进化,为不同品种猪遗传研究和分子育种工作提供参考20-21。尤其是处于 CDS 的 SNP 是高度稳定的,与微卫星等重复序列的多态性标记相比,其遗传稳定性更高17。本试验以蓝塘猪和大约克猪为研究对象,通过猪 TPM3基因全长 cDNA 序列(GenBank 登录号为 DQ266103)查找适用于群体的表型关联分析的猪 TPM3基因 cSNP位点,旨在为揭示不同品种猪肉质性状提供参考依据。1 材料1.1 试验动物健康肥育蓝塘猪 30 头,体重约为 60 kg,由广东省板岭原种猪场提供;健康肥育大约克猪 35 头,体重约为 90 kg,由广东中山白石猪场提供。1.2 主要试剂TRIzol 试 剂、限 制 性 内 切 酶 Pst、RNasin、Agarose Gel DNA Purification Kit 2.1、Taq 酶、ExTaq 酶、dNTPs、A-MLV 反 转 录 酶、Oligo(dT)18、Rbonuclease inhibitor 酶抑制剂、DL-2 000 Marker、反转录试剂盒,均购自 TaKaRa 公司;低熔点琼脂糖、乙二胺四乙酸(EDTA)标准溶液、三羟甲基氨基甲烷(Tris),购自生工生物工程(上海)股份有限公司;其他试剂均为国产分析纯产品。1.3 主要仪器超低温冰箱(-80)、电热鼓风干燥箱,均购自中国重庆实验设备厂;台式高速离心机、低温高速离心机、核酸蛋白测定仪,均购自德国 Eppendorf 公司;超净工作台、恒温水浴锅、电泳仪和电泳槽,均购自北京六一仪器厂;基因扩增仪,购自英国 HBRID 公司;紫外可见光透射仪,购自美国 FOTODYNE 公司;凝胶成像系统,购自 BIO-RAD 公司。2 方法2.1 样品的采集及 cDNA 的合成屠宰 30 头蓝塘猪和 35 头大约克猪,宰后 15 min内用消毒后的手术刀剥开倒数第 3,4 肋骨间背最长肌外的筋膜,取肌肉 1520 g,分割成小块,每块 23 g,放入一次性封口袋内并用灭菌纱布包好,做好标记后置液氮中速冻保存,备用。用 TRIzol 试剂在 A-MLV 反转录酶的作用下提取蓝塘猪和大白猪背最长肌总 RNA,再按照反转录试剂盒说明书合成 cDNA。2.2 TPM3基因 cDNA 序列多态性的检测2.2.1引物的设计与合成根据 GenBank 中猪TPM3 基因全长 cDNA 序列(登录号为 DQ266103),利用 Primer Premier 5.0 软件设计 2 对特异性引物,引物由上海博亚生物技术公司合成,引物信息见表 1。表 1 引物信息Table 1 Primer information基因片段名称引物名称引物序列预扩增片段大小/bpTPM3-CDS-1TPM3-CDS-1-FTPM3-CDS-1-R5-CGAGCGGAGGAGGCAGGAAC-35-TCCTCTGTGCGTTCCAAGTCTCCCTCAA-3484TPM3-CDS-2TPM3-CDS-2-FTPM3-CDS-2-R5-GAGGGAGACTTGGAACGCACAGAGGA-35-TGGTCCAGCATCCTTTGTGTACAGAG-33112.2.2 TPM3基因 cDNA 序列的 PCR 扩增TPM3-CDS-1 PCR 扩增体系(总体积为 15 L):上下游引物各 0.15 L,cDNA 模 板 1.5 L,Rtag Burffer 1.5 L,Mg2+0.6 L,dNTPs 0.5 L,Rtag 0.15 L,ddH2O 10.45 L。TPM3-CDS-1 PCR 扩增程序:94 预变性 3 min;94 变性 30 s,63 退火 40 s,72 延伸 45 s,共 35 个循环;72 再延伸 5 min;4 保存。取 PCR 产物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,回 收 产 物 测 序,并 用 BLAST 程 序 进 行 序列比对。TPM3-CDS-2 PCR 扩增体系(总体积为 15 L):上下游引物各 0.12 L,Rtag Burffer 1.5 L,cDNA 模板 1.5 L,Mg2+0.6 L,dNTPs 0.5 L,Rtag 0.12 L,ddH2O 10.54 L。TPM3-CDS-2 PCR 扩增842023(15):47-50,56畜牧科学程序:94 预变性 3 min;94 变性 30 s,63 退火30 s,72 延伸 45 s,共 30 个循环;72 再延伸5 min;4 保存。取 PCR 产物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,回收产物并测序,并用 BLAST 程序进行序列比对。2.3 TPM3基因 cDNA 序列 SNPs 位点的筛选使用 SeqMan 软件进行分析,根据测序峰图筛选TPM3基因 cDNA 序列的 SNPs 位点。3 结果与分析3.1 蓝塘猪和大约克猪 TPM3基因 cDNA 序列的PCR 扩增利用 TPM3-CDS-1-F/R 引物进行 PCR 扩增,得到长度为 484 bp 的目的条带(见图 1A);利用 TPM3-CDS-2-F/R 引物进行 PCR 扩增,得到长度为 311 bp的目的条带(见图 1B)。目的条带明亮单一,其大小与预期相符,未出现非特异性条带。图 1 PCR 扩增结果Fig.1 PCR amplification results3.2 蓝塘猪和大约克猪 TPM3基因 cDNA 序列 SNPs位点筛选用 BLAST 程序对 TPM3-CDS-1 引物扩增得到的产物序列进行比对,经 SeqMan 软件分析有 1 个多态性位点

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